第十五章 人類疾病動物模型復(fù)制
第一節(jié) 概述
由于人類疾病的復(fù)雜性，醫(yī)學(xué)研究中必須對疾病過程進(jìn)行各種觀察、分析和實(shí)驗(yàn)。這些工作大多不可能在人體上進(jìn)行，必須借助于適當(dāng)?shù)膭游锛捌淦鞴�、組織和細(xì)胞進(jìn)行研究。供醫(yī)學(xué)研究用的這些動物具有與所研究的人類疾病相似的特點(diǎn)，故稱之為人類疾病動物模型(animal models of human diseases)。人類疾病動物模型通�？梢酝ㄟ^人工誘發(fā)，或選擇具有相應(yīng)特點(diǎn)的自然動物而獲得。
人類疾病動物模型通常依照研究目的而設(shè)計，不同的研究選用的動物模型可有很大差別，所以人類疾病動物模型很多，也很復(fù)雜。許多人類疾病的動物模型可以自然獲得，即利用動物自發(fā)性的遺傳特性或通過育種手段培育遺傳特性建立而成，如裸鼠、肥胖癥小鼠、自發(fā)性高血壓鼠、自發(fā)性高膽固醇血癥鼠等。
更多的人類疾病實(shí)驗(yàn)動物模型是用人工方法，將致病因素作用于動物，誘發(fā)動物特定器官、組織、細(xì)胞或全身的損害，造成與所研究的人類疾病相似的機(jī)能、代謝和形態(tài)學(xué)的改變�？捎糜谡T發(fā)疾病模型的方法和因素很多，包括物理因素、化學(xué)因素、微生物因素以及基因工程技術(shù)等。
近年隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多地應(yīng)用生物工程技術(shù)方法制作動物模型，包括利用動物卵或胚胎移植、胚胎嵌合、細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因或基因敲除和克隆等技術(shù)制作人類疾病的動物模型。
復(fù)制的人類疾病動物模型是否能真正地、客觀地反映人類疾病是能否作為研究對象而用于醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵。但動物與人類之間存在著很大的差異，任何一種人類疾病的動物模型不可能與人類疾病完全相同，而且影響因素很多，所以在選擇和設(shè)計動物模型時要盡可能力求全面周密，在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時要充分考慮動物模型的局限性。
復(fù)制人類疾病動物模型有三點(diǎn)最基本的要求：一是復(fù)制模型選用的動物應(yīng)盡可能接近人類，建立的模型必須盡可能地與所研究的人類疾病有相同的或相近的機(jī)能、代謝和形態(tài)學(xué)變化特點(diǎn)，病變發(fā)生機(jī)理應(yīng)盡量與相應(yīng)的人類疾病相同；二是選用的方法要保證疾病動物模型復(fù)制有較高的成功率，具有較好的可重復(fù)性和一定的穩(wěn)定性，以供他人應(yīng)用和驗(yàn)證；三是復(fù)制成功的動物模型應(yīng)有明確而可靠的測量或觀察的指標(biāo)，以供判斷病變的輕重程度和病程的緩急。
應(yīng)該強(qiáng)調(diào)指出的是，動物模型的設(shè)計和選擇都要適合于研究的目的，即便研究同一疾病，但因研究的發(fā)病環(huán)節(jié)不同也不可套用同一動物模型。
本章節(jié)選擇性的介紹幾種嚴(yán)重威脅人類生命的疾病和綜合征的動物模型復(fù)制方法，供學(xué)生在探索性實(shí)驗(yàn)階段參考。
第二節(jié) 動脈粥樣硬化模型
動脈粥樣硬化（Atherosclerosis, AS)性疾病是目前危害人類健康的“頭號殺手”，動脈粥樣硬化斑塊的形成最常見于大、中動脈。動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展過程大致如下：由于血漿脂質(zhì)水平的升高或同時有其他危險因子的存在，使動脈內(nèi)皮發(fā)生了某種損傷性變化，使血漿脂質(zhì)易于通過動脈內(nèi)膜進(jìn)入內(nèi)膜下間隙并沉積。同時血流中的單核細(xì)胞易與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生粘附，并通過內(nèi)皮細(xì)胞間隙跨過內(nèi)皮進(jìn)入內(nèi)皮下，攝取大量脂質(zhì)而轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，形成脂質(zhì)條紋，隨后血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜方向遷移，并攝入脂質(zhì)和合成大量細(xì)胞間質(zhì)，導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊形成。
AS研究領(lǐng)域中經(jīng)常使用動物模型作為實(shí)驗(yàn)對象，獲得大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大大促進(jìn)了人們對AS的認(rèn)識。本節(jié)主要介紹實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化動物模型和泡沫細(xì)胞模型的復(fù)制方法。
一、動脈粥樣硬化動物模型的復(fù)制
（一)家兔
家兔是復(fù)制動脈粥樣硬化模型最常用的動物，它對外源性膽固醇的吸收率高，可達(dá)75～95%，靜脈注入膽固醇后高脂血癥可持續(xù)3～4天。只要給兔含膽固醇較高的飼料，不必附加其它因素，經(jīng)3～4月即可形成明顯的動脈粥樣硬化病變，而且與人體發(fā)生的病變相似，取血檢查也較方便。
通常選用體重2kg左右的新西蘭白兔或日本大耳白兔，每天喂服基礎(chǔ)飼料加膽固醇0.3g，4個月后肉眼可見主動脈粥樣硬化病變；若每天膽固醇劑量增至0.5g，3個月后可出現(xiàn)病變；若增至每天1g，可縮為2個月。在基礎(chǔ)飼料中加入15%蛋黃粉、0.5%膽固醇和5%豬油，經(jīng)3周后，將飼料中膽固醇減去，再喂3周，可使主動脈病變發(fā)生率達(dá)100%，血清膽固醇可增高至2000mg%。
促進(jìn)病變形成的方法：
1．在高脂飼料中還可加入甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶、甲亢平、苯丙胺、維生素D、煙堿或蔗糖等；
2．預(yù)先用Fogarty球囊導(dǎo)管插入主動脈，造成內(nèi)皮細(xì)胞剝脫的淺表損傷，再喂高脂飼料；
3．靜脈滴注去甲腎上腺素引起血管壁中層彈性纖維拉長、劈裂或斷裂；
4．皮下注射同型半胱氨酸硫代內(nèi)脂（dl-homocysteinethiolactone)可明顯促進(jìn)動脈粥樣硬化病變。
（二)其他動物
除田鼠和地鼠外，一般溫血動物只要用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ寄苄纬蓜用}粥樣硬化的斑塊病變。已經(jīng)用于復(fù)制動脈粥樣硬化模型的動物除兔以外，還有雞 、鴿 、猴 、豬等。 具體選取哪種動物來復(fù)制模型，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募坝^察指標(biāo)、實(shí)驗(yàn)時間等。
（三)動脈粥樣硬化動物模型的鑒定
處死動物，選取觀測的動脈，剪開剖面，用蘇丹Ⅳ或者油紅O染色，使病變面積呈現(xiàn)紅色，用計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)或求積儀計算病變面積百分比。根據(jù)病變面積百分比進(jìn)行病變分級，判斷粥樣硬化病變的程度。按病變面積百分比分級標(biāo)準(zhǔn)見表15-1。
表15-1 按病變面積百分比分級標(biāo)準(zhǔn)
| 分級 病變面積(%) |
| Ⅰ <5 Ⅱ 6-15 Ⅲ 16-33 Ⅳ 34-50 Ⅴ >50 |
二、泡沫細(xì)胞模型的復(fù)制
巨噬細(xì)胞和增殖移行的中膜平滑肌細(xì)胞表面存在有清道夫受體（scavenger receptor)，能無反饋地攝取大量修飾變性的低密度脂蛋白（LDL)，特別是氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)，使細(xì)胞內(nèi)充滿大量脂滴，呈泡沫狀，稱為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞是動脈粥樣硬化病變重要的特征性細(xì)胞，所以常用Ox-LDL與巨噬細(xì)胞或血管平滑細(xì)胞共孵育，形成泡沫細(xì)胞，作為動脈粥樣硬化研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>
（一)LDL的制備和氧化修飾
1．LDL的制備：見有關(guān)專業(yè)書籍。
2．Ox-LDL的制備（LDL的氧化修飾)：
在氧化前，LDL先用無EDTA的PBS液透析24小時，以除去EDTA；再將LDL在含10μmol/LCuSO4的PBS中，于37℃氧化12小時；然后于4℃，在含100mg/LEDTA的PBS中透析，每8小時換液一次，透析24小時；最后過濾除菌，4℃保存。
（二)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)是把從人體或動物體上取得的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單個的細(xì)胞懸液，然后在模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的體外條件下，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存并生長。泡沫細(xì)胞模型的細(xì)胞來源于單核巨噬細(xì)胞或血管壁平滑肌細(xì)胞。
通常多用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與OxLDL共孵育以培養(yǎng)泡沫細(xì)胞。步驟如下：選取8周齡、無感染的小鼠，眼球放血或頸椎脫位致死；用70%酒精消毒腹部皮膚，在無菌條件下，用鑷子提起腹部皮膚剪去約3～5厘米長的皮膚，暴露去皮的腹壁；再用注射器將3～4ml無血清的1640培養(yǎng)液注入腹腔，輕揉片刻后抽出腹腔液；將其注入離心管，于4℃，1000rpm/min離心10分鐘，去上清液，加同樣培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1～5×106/ml。若需要的細(xì)胞數(shù)多，可將數(shù)只小鼠的細(xì)胞收集在一起。而豚鼠、家兔腹腔巨噬細(xì)胞的取得，需在數(shù)日前于腹腔注射石蠟油誘發(fā)巨噬細(xì)胞在腹腔聚集。
由于巨噬細(xì)胞有很強(qiáng)黏附能力，要分離它最常用的方法是貼壁法，即將含有巨噬細(xì)胞的懸液加到蓋玻片上、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃培養(yǎng)30～60分鐘，巨噬細(xì)胞開始貼壁，此時用Hanks液沖洗5次，以洗去未貼壁的其他細(xì)胞，最后得到較純的巨噬細(xì)胞，加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱。由于巨噬細(xì)胞是終末細(xì)胞，故不能長期傳代培養(yǎng)。
血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)可參閱有關(guān)書籍。
培養(yǎng)的腹腔巨噬細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞傳至3～5代，培養(yǎng)瓶換培養(yǎng)液后，加入已制備好的Ox-LDL，培養(yǎng)48～72小時，觀察細(xì)胞形態(tài)的改變及測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。
（三)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察
將貼壁于蓋玻片的細(xì)胞取出，以PBS液沖洗3次，于10%甲醛中固定24小時，用油紅O方法染色。在倒置顯微鏡下觀察，并以10×100倍彩色照相。
（四)細(xì)胞內(nèi)膽固醇（Ch)和膽固醇酯(ChE)的測定
用0.25%胰酶消化1min，收集細(xì)胞，以1000rpm/min離心10min，棄去上清液，用PBS液沖洗一次，加入異丙醇0.5ml，在超聲波清洗器上震動10s/min×3次，再以1000rpm/min離心15min。吸取上清液用TC試劑藥盒及FC試劑藥盒分別測定其總膽固醇（TC)和游離膽固醇（FC)，并將其離心沉淀物用0.1mol/LNaOH 0.5ml裂解細(xì)胞，用Lowry法測定細(xì)胞蛋白含量。細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量以TC/g細(xì)胞蛋白和FC/g細(xì)胞蛋白表示，兩者之差即為ChE/g細(xì)胞蛋白含量。
（楊永宗)
第三節(jié) 糖尿病動物模型
糖尿�。╠iabetes mellitus)是一種古老的疾病，關(guān)于糖尿病的記載，最先見于文明古國中國、印度、埃及等國家，約有一千余年至數(shù)千年的歷史。近年來糖尿�。╠iabetesmellitus)的研究進(jìn)展迅速，雖然許多新的發(fā)現(xiàn)和成就充實(shí)了對本病的認(rèn)識，但病因及發(fā)病機(jī)理方面仍未完全闡明。
糖尿病以持續(xù)高血糖為基本生化特征，其病因目前尚無定論。糖尿病不是單一原因與發(fā)病機(jī)制引起的疾病，而是由不同原因引起的體內(nèi)胰島素缺乏或胰島素效應(yīng)降低，臨床以糖代謝紊亂為主的一組代謝性疾病的總稱。按WHO1985年的分型標(biāo)準(zhǔn)，它分為：胰島素依賴型（IDDM，Ⅰ型)、胰島素非依賴型（NIDDM，Ⅱ型)、營養(yǎng)不良性糖尿�。á笮�)和其它類型。IDDM患者的基礎(chǔ)及葡萄糖負(fù)荷后胰島素分泌均呈現(xiàn)低水平狀態(tài)，反映了胰島素的完全缺如或嚴(yán)重缺乏。NIDDM患者胰島素分泌功能障礙較輕，表現(xiàn)在第一時相缺如及分泌高峰后移，該類患者基礎(chǔ)胰島素分泌常增高或正常，而胰島對葡萄糖刺激的反應(yīng)減弱，在葡萄糖負(fù)荷后胰島素分泌水平較相應(yīng)體重為低。一般認(rèn)為IDDM和NIDDM的發(fā)病與自身免疫、遺傳、病毒感染、胰島素抵抗等有關(guān)，繼發(fā)性糖尿病的病因多數(shù)較清楚。在這些因素的作用下，發(fā)生了胰島素的缺乏和作用減低，從而引起體內(nèi)代謝紊亂，導(dǎo)致血糖升高。
對糖尿病研究的重要方法之一是復(fù)制糖尿病動物模型，目前能夠用來復(fù)制糖尿病模型的動物有地鼠（Carpenter,1970)、大鼠（Maner,1972)、小鼠（Butler,1972)、豚鼠（Munger,1973)、狗（Kramer,1980)、貓（Johnaon,1973)、兔（Roth,1980)、豬（Lang,1977)和靈長類（Howard,1980)。復(fù)制糖尿病動物模型有多種，按產(chǎn)生原因分為：（1)自發(fā)性動物模型（spontaneousanimal model)，指實(shí)驗(yàn)動物在自然條件下自然產(chǎn)生的、或由于基因突變而出現(xiàn)的類似人類疾病的動物疾��；（2)誘發(fā)性動物模型（experimentalartificial or induced animal model)，指通過物理、化學(xué)、生物等致病手段，人為造成動物組織、器官或全身形成類似人類的疾病，動物在功能、代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面有相應(yīng)的改變。
一、動物模自發(fā)性型
（一)小鼠
KK糖尿病小鼠是1941年K.Kondo用日本商人的kasukabe小鼠原種群培育而成的，屬先天性遺傳缺陷小鼠。該動物對胰島素不敏感、對葡萄糖耐性小、糖尿病發(fā)病率高、老年動物偶見肥胖。
（二)大鼠
BB Wistar大鼠是一種典型自發(fā)遺傳IDDM型糖尿病動物模型，85日齡出現(xiàn)癥狀，發(fā)病率為50％～70％，臨床表現(xiàn)為多飲、多食、糖尿病、高血壓、酮癥，病鼠胰島內(nèi)β-細(xì)胞大量破壞，病理學(xué)改變?yōu)橐葝u炎，伴有外周神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重病變、睪丸萎縮、甲狀腺炎、胃潰瘍、惡性淋巴瘤等。該型與人類發(fā)病年齡較早的少年型糖尿病極為相似。
NIH肥胖大鼠品系（SHR/N-cp)是新培育的一種用于肥胖癥和糖尿病研究的遺傳動物模型。其特征主要是脂肪聚集層，脂肪細(xì)胞體積和數(shù)量增加并有損傷發(fā)熱作用。雄性肥胖大鼠有輕度高血壓，當(dāng)飼喂高糖飲食時，表現(xiàn)出與人NIDDM型糖尿病相似的代謝改變，包括胰島素分泌過多、高血脂，不耐葡萄糖和糖尿病。
（三)地鼠
中國地鼠（黑線倉鼠)有50％自發(fā)性產(chǎn)生糖尿病，屬多基因遺傳，病鼠耐糖曲線似人類NIDDM糖尿病。
（四)新西蘭白兔
美國退伍軍人管理局醫(yī)療中心于1969年發(fā)現(xiàn)一只6～12月齡的雌性新西蘭白兔有煩渴和多尿現(xiàn)象，血糖和尿糖均明顯增高，確診為糖尿病。經(jīng)連續(xù)幾代近親繁殖，遂形成具有自發(fā)性糖尿病的一個品系。其中19％為顯著高血糖及糖尿的顯性糖尿病兔，另外27％的兔空腹血糖正常但處理靜脈注射葡萄糖能力異常。這兩種兔的其他一些特征包括煩渴、多尿、貪食、胰島素釋放嚴(yán)重受損及胰島β細(xì)胞顆粒增多。這些兔不肥胖，且有輕度酮癥酸中毒。病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，糖尿病兔的特殊損害局限在胰島β細(xì)胞及腎臟。本動物模型與人類的IDDM或青少年中成年發(fā)作型糖尿病極為相似。
二、 誘發(fā)性動物模型
誘發(fā)性糖尿病動物模型的復(fù)制方法有多種，包括手術(shù)、化學(xué)物質(zhì)損傷、微生物感染、營養(yǎng)源性誘導(dǎo)等等。
（一)手術(shù)
自從德國的Von Mening將犬作胰腺全切除術(shù)造成糖尿病后，陸續(xù)報道貓、大鼠、兔、豬、猴等切除80％～90％胰腺并受到高糖飲食刺激后，出現(xiàn)β細(xì)胞退變衰竭而引起永久性糖尿病。
（二)化學(xué)物質(zhì)損傷
用化學(xué)物質(zhì)損傷來復(fù)制糖尿病動物模型，可用的方法有：
1．注射致高血糖因子；
2．注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ)；
3．注射環(huán)丙庚哌；
4．注射四氧嘧啶（alloxan)破壞胰島β細(xì)胞，造成胰性糖尿�。�
5．注射根皮苷。一般以后兩種方法最常用。
(1)四氧嘧啶
①復(fù)制機(jī)理
用適量的四氧嘧啶注入動物體內(nèi)，可選擇性地?fù)p害胰島的β細(xì)胞，使β細(xì)胞制造胰島素的功能發(fā)生障礙而導(dǎo)致血糖過高和糖尿病。這是由于四氧嘧啶化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，易與巰基（主要是半胱氨酸)發(fā)生反應(yīng)，而胰島的β細(xì)胞中巰基含量較其他組織為多，故四氧嘧啶只選擇性地?fù)p害胰島的β細(xì)胞。
四氧嘧啶復(fù)制的糖尿病動物模型是目前研究人類糖尿病較好的方法，主要優(yōu)點(diǎn)有：（a)實(shí)驗(yàn)性糖尿病近似人類糖尿��；（b)體內(nèi)代謝障礙時有可能產(chǎn)生此種衍生物；（c)胰島外分泌部分不受損傷；（d)幾乎所有常用實(shí)驗(yàn)動物都可用來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；（e)胰島的β細(xì)胞不是功能消失，而是功能不同程度的降低，有利于研究胰島組織再生和功能恢復(fù)；（f)動物不必注射胰島素可存活很久。
②復(fù)制方法
大白鼠 實(shí)驗(yàn)前四天，給大白鼠腹腔內(nèi)注射新鮮配制的四氧嘧啶（2.5％或5％生理鹽水溶液)，劑量為12mg/100g體重。注射后血糖呈幾個時相的變化，在注射第四、五天后即可造成持續(xù)高血糖。實(shí)驗(yàn)中每天注意給動物充分供應(yīng)飲水，以便獲得較多尿量，用以測定尿中糖含量。如在冬季，大白鼠飲水少，則可由食管插管按5ml/100g體重喂水。
家兔 取體重1.5kg以上健康家兔，先測定正常血糖量，并檢查尿內(nèi)有無糖后，靜脈注射四氧嘧啶溶液150～200mg/kg體重，然后有計劃地觀察血糖、尿糖、體重和食欲情況的變化。有的家兔在注射后10～15天排除中毒現(xiàn)象后，即可正式進(jìn)行四氧嘧啶性糖尿病的實(shí)驗(yàn)觀察。
家犬 實(shí)驗(yàn)前二周，靜脈注入新鮮配制的四氧嘧啶溶液（1～3％)，劑量為50～60mg/kg體重。在注射后24～48小時，即可出現(xiàn)持久性的高血糖和糖尿。
注意事項(xiàng)：四氧嘧啶模型與人的糖尿病類似，但注射藥物后，血糖值迅速下降，繼而又很快上升且有幾次起伏，幾天后方形成持久性高血糖。另外，注射四氧嘧啶后，有時可在24小時以內(nèi)死于低血糖昏迷，可用50％葡萄糖水溶液喂動物搶救。
(2)根皮苷
①復(fù)制機(jī)理
根皮苷是一種配糖體，系由蘋果樹的根皮抽提而得。其所以引起糖尿病，是因?yàn)楦ぼ漳苁鼓I小管對糖的再吸收發(fā)生障礙（排糖閾降低)。根皮苷可能有破壞酯酶的作用，致使葡萄糖磷酸化過程和脫磷酸過程障礙，引起糖尿病。
②復(fù)制方法
使用的動物為健康家兔，首先測定正常血糖含量和尿糖定性，在確定血糖含量處于正常范圍內(nèi)和尿內(nèi)無糖時，以0.5％根皮苷按15ml/kg體重的劑量作皮下注射，同時收集24小時尿液，然后測定血糖含量和尿糖定性。為了增加尿量，可多飼以白菜。
注意事項(xiàng)：根皮苷溶液要新鮮配制，配時取0.5g根皮苷溶于100ml的1％NaHCO3溶液中。
(3) 鏈脲佐菌素
一次性腹腔注射或靜脈注射30mg/kg～100mg/kg，幾天后使狗、大鼠等動物產(chǎn)生永久性高血糖，但鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ)造成糖尿病的同時，還可造成白內(nèi)障、冠狀動脈粥樣硬化斑塊。
(4)環(huán)丙庚烷（cyproheptadine)
給大鼠連續(xù)給藥4周后，可見高血糖癥狀，并出現(xiàn)胰島素β細(xì)胞的分泌顆粒逐漸消失。胰島素分泌在安靜時呈正常值，當(dāng)補(bǔ)充葡萄糖過量時，則不能引起胰島素的補(bǔ)充分泌，這與人類糖尿病患者動態(tài)極為相似，停藥一周后，病態(tài)可自動恢復(fù)，該模型比上述模型更接近于人體發(fā)病形式。
（三)微生物感染
腦炎心肌炎（EMC)病毒的M型變異株可在若干品系的成年小鼠中誘發(fā)糖尿病。在DBA/2品系小鼠中發(fā)病率大于70％，而在CD-1小鼠中約為40％，在C3H、C57BL、BALB/CJ與A/J小鼠中發(fā)病率少于10％。雌雄均能感染EMC病毒，雄性的發(fā)病率明顯大于雌性。 皮下接種病毒4～7天后可出現(xiàn)明顯的高血糖，伴有血中及胰腺組織中胰島素含量降低。高血糖通常為短暫性，但許多小鼠在恢復(fù)期仍顯示糖耐量異常。EMC病毒感染小鼠后出現(xiàn)的疾病在生化方面與人類青少年發(fā)病的IDDM糖尿病極為相似。
（四)營養(yǎng)源性
用含10％氧化的長頷竹刀魚油的飼料喂養(yǎng)鯉魚60天，即能誘發(fā)鯉魚營養(yǎng)源性糖尿病。本病的臨床特征包括高血糖、糖尿、糖耐量降低與偶有酮尿。組織學(xué)研究表明其胰島、腎小球等部位的損害與人類糖尿病中所見者極相似。該疾病模型與人類青少年發(fā)病的IDDM糖尿病極為相似。
最近有報道，用含10％豬油、37％蔗糖的飼料喂養(yǎng)新西蘭白兔也能誘發(fā)糖尿病，但該模型尚在研究中。
（五)轉(zhuǎn)基因糖尿病動物模型
雖然轉(zhuǎn)基因動物這一生命科學(xué)研究的新體系引入到糖尿病的研究領(lǐng)域時間并不長，但已取得了驚人的成果。轉(zhuǎn)基因動物模型在糖尿病研究中的運(yùn)用仍然方興未艾。1998年，Allison等在《Nature》上報道，第一類組織相容性抗原復(fù)合物（MHC-1)基因（H-2Kb)，該基因是大鼠的胰島素啟動子，在小鼠的胰腺β細(xì)胞中高表達(dá)，復(fù)制成轉(zhuǎn)基因小鼠。這種動物模型的胰島素分泌降低，與人類的IDDM糖尿病相似。
利用轉(zhuǎn)基因的方法建立人類疾病動物模型和用其他方法相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。諸如遺傳背景清楚，遺傳物質(zhì)改變簡單，建立的模型更自然和更接近病人癥狀；建立過程操作簡單，周期短，而且建立的轉(zhuǎn)基因動物模型不需要特殊的飼養(yǎng)條件即可保持疾病癥狀，按照孟德爾規(guī)律代代相傳，維持費(fèi)相對較低等等。但是由于轉(zhuǎn)基因方法和技術(shù)上的原因，目前轉(zhuǎn)基因糖尿病動物模型尚處于研究階段，相信隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型會不斷涌現(xiàn)。
（袁中華)
第四節(jié) 心、腦缺血-再灌注損傷動物模型
心、腦血管缺血性疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的一大類疾病，椐統(tǒng)計，我國每年新發(fā)生的腦卒中有150萬人，每年死于心血管疾病的在200萬人以上，恢復(fù)缺血組織的血液灌注是治療的目的，但在某些情況下，再灌注會加劇組織的損傷，其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。因此，研究心、腦缺血-再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制及其防治，具有重要的理論價值和實(shí)踐意義。
一、在體心臟缺血-再灌注損傷模型
（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
復(fù)制心臟缺血-再灌注損傷動物模型，觀察再灌注過程中心功能的變化及再灌注性心律失常表現(xiàn)。為研究心臟缺血-再灌注損傷的機(jī)制及其防治打下基礎(chǔ)。
（二)實(shí)驗(yàn)動物
雄性健康大白鼠，體重200~300克。
（三)藥品、器材
多功能生物信息采集儀或二道生理記錄儀，小動物人工呼吸機(jī)，小動物常規(guī)手術(shù)器械，左心室導(dǎo)管，直徑3mm 、長2cm的充氣硅膠管，小拉鉤。小圓針，5/0號線。
（四)觀察指標(biāo)
1．心電圖
2．心功能檢測指標(biāo)：左室內(nèi)壓（LVP)，左室內(nèi)壓變化最大速率（±dp/dtmax)，左室舒張末期壓（LVEDP)
（五)實(shí)驗(yàn)步驟
1．動物稱重后，腹腔內(nèi)注射12%水合氯醛40mg/100g體重麻醉動物，并將其仰臥固定
于手術(shù)臺上。
2．作頸部正中切口，分離氣管并插入氣管插管，分離右頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端用動脈夾夾閉，在靠近結(jié)扎線處剪口，插入左心室導(dǎo)管，用線輕扎固定后松開動脈夾，然后將導(dǎo)管緩慢插入左心室，雙重結(jié)扎固定，并連接多功能生物信息采集儀或生理記錄儀用于測定心功能，連接標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖。
3．胸骨左側(cè)旁約0.5cm處、第3~5肋間作切口開胸，立即行呼氣末正壓呼吸（吸室內(nèi)空氣，通氣量為2ml/100g體重，呼吸頻率50~60次/min)，剪開心包膜暴露心臟，以左冠狀動脈為標(biāo)志，在左心耳根部下方2mm處用穿好5/0號線的無創(chuàng)小圓針穿過左冠狀動脈下方的心肌表層，在肺動脈圓椎旁出針，將心臟放回原處。
4．待心電圖穩(wěn)定10分鐘后記錄心電圖、LVEDP及±dp/dtmax 。
5．靜脈注入肝素100~200U, 在左冠狀動脈穿線上方放置硅膠管并結(jié)扎動脈，使之壓迫血管造成血管閉塞和左室壁缺血5~10分鐘，每隔2分鐘記錄心電圖及心功能指標(biāo)，然后剪開結(jié)扎線，移去硅膠管，恢復(fù)血液灌流，繼續(xù)觀察30~60分鐘。
6．記錄解除結(jié)扎即刻及隨后動態(tài)的心電圖和心功能指標(biāo)變化。
二、離體心臟缺血-再灌注損傷模型
（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
學(xué)習(xí)Lagendorff離體心臟灌流技術(shù)，復(fù)制離體心臟缺血-再灌注損傷模型，觀察再灌
過程中心臟功能、代謝及心電圖的變化。為研究心臟缺血-再灌注損傷的機(jī)制及其防治打下基礎(chǔ)。
（二)實(shí)驗(yàn)動物
健康雄性大鼠，體重200~300克。
（三)藥品、器材
Lagendorff離體心臟灌流裝置，超級恒溫水浴，恒溫水浴器，氧氣袋，O2 、CO2、N2鋼瓶，721分光光度計，多功能生物信息采集儀，天平，小動物手術(shù)器一套，Krebs-Henseleit緩沖液（K-H液)，水合氯醛，肝素，玻璃插管等。
（四)觀察指標(biāo)
1．冠脈流出量（ml/min/g組織濕重)；
2．乳酸脫氫酶（LDH)含量；
3．心電圖；
4．心功能：±dp/dtmax, LVP，LVEDP 。
（五)方法、步驟
1．Lagendorff離體心臟灌流模型的制備
（1)物稱重后用12%水合氯醛40mg/100g體重（或氯氨酮8~10mg/100g體重)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，經(jīng)尾靜脈或股靜脈注入肝素鈉100~150U/100g體重，注射完畢后2分鐘開始手術(shù)。
（2)肋骨下緣橫向剪開腹前壁，再縱向剪開兩胸側(cè)壁和橫膈前緣，將胸壁向頭端翻起分離出心臟后以左手姆指和食指輕輕提起，暴露出各大血管，在距主動脈起始部4~5mm處，用眼科剪將肺與心臟一同剪下，置于預(yù)冷的0оC~4оC的K-H液中。
（3)立即行主動脈插管、固定，并迅速經(jīng)插管（可用注射器與之相連)注入K-H液，沖洗出冠脈血管內(nèi)的殘留血液，然后將主動脈插管與Lagendorff灌流裝置相連，讓心臟懸掛于灌流裝置上,灌流約30秒。
（4)肺動脈圓錐處剪一小口，用線結(jié)扎肺門根部血管，剪去肺及縱隔組織。
（5)左心房插管與前負(fù)荷瓶相連，荷包縫合固定；調(diào)整左室前負(fù)荷為15cmH2O(147Pa),待心跳規(guī)則后，即改為從左心房導(dǎo)管灌入K-H液，液體經(jīng)左室收縮泵入主動脈，部分液體進(jìn)入冠脈，流至右房，經(jīng)右心室從肺動脈圓錐流出，收集在燒杯中，用來測定冠脈流出量及乳酸脫氫酶含量，左室后負(fù)荷為60~75mmHg (8~10kPa)。持續(xù)向K-H液中通以（95%O2+5%CO2)混合氣體。灌注壓為7.9 kPa,灌注速度為10ml/min 。心臟維持濕潤及37ΟC恒溫。
（6)經(jīng)心尖部向左心室插入心導(dǎo)管，與壓力傳感器及多功能生物信息采集儀相連，測定心功能；連接心電圖描記裝置記錄心電圖；穩(wěn)定10分鐘后，記錄各指標(biāo)。乳酸脫氫酶（LDH)含量測定方法見藥盒說明。
2．心臟缺血-再灌注損傷模型的制備
（1)用穿好5/0號線的無創(chuàng)小圓針穿過左冠狀動脈下方的心肌表層，在肺動脈圓椎旁出針，在血管上方放置一小段硅膠管并結(jié)扎造成左心缺血10~20min ，記錄結(jié)扎前及結(jié)扎后即刻、5min、10min、15min、20min心電圖及心功能變化，并測定冠脈流出量及LDH。
（2)松開結(jié)扎恢復(fù)灌流，繼續(xù)觀察10~20min ，并在松開結(jié)扎后即刻、30s、60s、1min、2min 、5min、10min、15min、20min記錄上述指標(biāo)的變化。
3． 氧反常及鈣反常的復(fù)制
（1)氧反常的復(fù)制方法：仍采用上述Lagendorff離體心臟灌流模型,先用通入（95%O2+5%CO2)混合氣體的K-H液灌流20min , 然后改用無糖的、通入（95%N2+5%O2)混合氣體的K-H液灌流90~120min , 再恢復(fù)先前的富氧含糖K-H液灌流5~10min,并動態(tài)記錄前述指標(biāo)變化.
（2)鈣反常的復(fù)制方法: 采用Lagendorff離體心臟灌流模型,先用富氧含鈣的K-H液灌流20min ,然后改用富氧無鈣的K-H液灌流5~10min,再恢復(fù)富氧含鈣K-H液灌流, 繼續(xù)觀察5~10min , 并動態(tài)記錄前述指標(biāo)變化.
附：K-H液的組成（mmol/L)：NaCl:118, KCl: 4.7,MgSO4,:1.1,KH2PO4:1.18, NaHCO3: 24.5, CaCl2:2.55。Glucose:11.1（臨用前加)，pH 7.4 。
三、腦的缺血-再灌注損傷模型
（一)四血管阻斷模型
1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
復(fù)制腦缺血-再灌注損傷的動物模型，觀察動物腦再灌注損傷的表現(xiàn)，為研究腦缺血-再灌注-損傷的機(jī)制及其防治打下基礎(chǔ)。
2、實(shí)驗(yàn)動物
雄性健康大白鼠，體重200~300克。
3、藥品、器材
多功能生物信息采集儀，小動物人工呼吸機(jī)，三棱針，不銹鋼電極，小動物手術(shù)器械，12%水合氯醛等。
4、觀察指標(biāo)
腦電圖，瞳孔及結(jié)膜顏色，心電圖。
5、實(shí)驗(yàn)步驟
（1)物稱重后，用12%水合氯醛40mg/100g體重行腹腔麻醉。
（2)臥位固定，沿頭頂部正中線切開皮膚，在右冠狀縫后，中線旁開各約1mm處用三棱針鉆透顱骨達(dá)骨膜外，將開口稍加擴(kuò)大，安裝不銹鋼電極，作記錄腦電圖用。
（3)將動物改為仰臥位，作頸部正中切口，分離氣管并插管固定；分離兩側(cè)頸總動脈，置套扣備用。
（4)將頸部切口稍往下延伸沿右側(cè)頸總動脈向近心端分離，找到鎖骨下動脈的起始段，分離鎖骨下動脈并穿線備用；沿左頸總動脈向下分離，找到左鎖骨下動脈的起始段，分離該動脈并穿線備用。
（5)使用小動物呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸（通氣量為2ml/100g體重，呼吸頻率48~50次/min)；將安裝在頭頂部的不銹鋼電極與多功能生物信息采集儀的腦電圖負(fù)極相連，再將參比電極插在同側(cè)耳根皮下，然后連接標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)，同步記錄腦電圖和心電圖。
（6)用小動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈和鎖骨下動脈，分別于夾閉后即刻、5min、10min和15min重復(fù)記錄腦電圖和心電圖，并觀察瞳孔和結(jié)膜顏色的變化。
（7)松開動脈夾，于松開后即刻、10min、20min、40min和60min記錄腦電圖和心電圖，并密切觀察瞳孔和結(jié)膜顏色的變化。
此模型可住院醫(yī)師造成動物全腦缺血-再灌注損傷，成功率較高，穩(wěn)定可靠，但對呼吸循環(huán)影響較大，必須使用人工呼吸機(jī)。
（二)線栓大腦中動脈模型
本方法的特點(diǎn)是在不開顱的情況下，用尼龍線栓塞大腦中動脈造成局灶性腦缺血，抽出尼龍線形成再灌注。在實(shí)驗(yàn)操作上是分離出頸內(nèi)、外動脈后，將頸外動脈的分支及其終末支以及頸內(nèi)動脈的的顱外分支全部結(jié)扎，使頸內(nèi)動脈成為頸總動脈在顱外的唯一分支，然后導(dǎo)入尼龍線。
1、實(shí)驗(yàn)動物
大鼠，體重350~ 500g 。
2、藥品、器材
12%水合氯醛、0.3mm的硅化的尼龍線、小動脈手術(shù)器械等
3、實(shí)驗(yàn)步驟
（1)用12%水合氯醛（40mg/100g體重)行腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上。
（2)頸部正中切口，在一側(cè)肩胛舌骨肌和胸鎖乳突肌形成的暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，然后分離頸外動脈的分支枕動脈、甲狀腺上動脈、舌咽動脈及其終末分支，并結(jié)扎之。分離頸內(nèi)動脈及其顱外分支，并將其顱外分支結(jié)扎。
（3)動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，用一線繞住頸外動脈的殘余部并在結(jié)扎線的下方（近頸內(nèi)、外動脈的分支處)剪一小口，由此插入預(yù)先硅化好的3cm長、0.3mm粗的尼龍線，松開頸內(nèi)動脈夾，小心地將尼龍線導(dǎo)入頸內(nèi)動脈，并仔細(xì)觀察辨認(rèn)位置是否正確，然后繼續(xù)向前推進(jìn)至頸內(nèi)動脈的顱內(nèi)段（從插入前端到頸總動脈分支處長度約為2cm)，當(dāng)有明顯的阻力感時，即可阻斷大腦中動脈。
本模型的優(yōu)點(diǎn)是無須開顱，重復(fù)性好，與臨床較為接近，適用于腦缺血-再灌注損傷的病理生理研究。缺點(diǎn)是手術(shù)方法較為煩瑣。
4、大鼠局灶性腦缺血評分方法：大鼠清醒后，根據(jù)其行為評分：
（1)提鼠尾離地面約1尺，有左肩內(nèi)旋、左前肢內(nèi)收者，記4分，否則為0分，正常鼠則兩前肢對稱地伸向地面。
（2)將動物置平滑地板上，分別推左（或右)肩使其向?qū)?cè)移動，檢查抵抗推動的阻力，若發(fā)現(xiàn)推其右肩向左側(cè)移動時阻力明顯低于對側(cè)者，根據(jù)其降低程度的不同，記1~3分，正常大鼠兩側(cè)阻力明顯對稱。
（3)將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力，若左前肢肌張力低于對側(cè)者，視其降低的程度，記1~3分，正常大鼠兩前肢肌張力明顯對稱。以上評分滿分為10分，記分越高，說明缺血-再灌注損傷越嚴(yán)重。還可將腦組織染色測定梗塞面積，根據(jù)梗塞面積大小判定損傷的程度。
(馮大明)
第五節(jié) 胃癌實(shí)驗(yàn)動物模型
胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，尤其在我國的發(fā)生率和死亡率仍居首位。建立類似人胃癌的動物模型是研究胃癌的病因、發(fā)生、發(fā)展及實(shí)驗(yàn)性防治的重要手段和方法。胃癌實(shí)驗(yàn)動物模型分為誘發(fā)性與移植性兩大類。
一．誘發(fā)性胃癌模型
理想的實(shí)驗(yàn)性胃癌模型必須具備下列要求：①致癌物質(zhì)必須容易合成或取得；②能在各種動物中致癌；③致癌方法簡單易行；④致癌周期短，癌變率高；⑤對胃有特異選擇性；⑥所誘發(fā)的胃癌的病理類型、生物學(xué)行為、電鏡表現(xiàn)及組織化學(xué)改變等與人類胃癌有相似性。
（一)致癌劑（carcinogen)
目前，誘發(fā)性實(shí)驗(yàn)性胃癌采用的致癌劑多為亞硝胺類，如甲基硝基亞硝基胍（MNNG)、甲基硝基亞硝基脲（ENNG)、甲基芐基亞硝胺（MBNA)等或芳香多環(huán)烴類（如3－甲基膽蒽、3，4－苯并芘、7，12－二甲基膽蒽、20－甲基膽蒽等)。
（二)實(shí)驗(yàn)動物（experimentalanimal)
實(shí)驗(yàn)性胃癌模型的成功與否和實(shí)驗(yàn)動物的選擇密切相關(guān)。一般所用的實(shí)驗(yàn)動物有大鼠、小鼠、地鼠、犬等，而最常用的是大鼠，其飼養(yǎng)方便，胃癌誘發(fā)率高。大鼠的胃分為前胃和腺胃兩部分，前胃占整個胃的1/3~1/2左右，由鱗狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，腺胃由腺上皮細(xì)胞構(gòu)成，前胃和腺胃之間有高出粘膜的界嵴相隔。因此。前胃誘發(fā)的是鱗狀細(xì)胞癌，腺胃誘發(fā)的是腺癌。實(shí)驗(yàn)證明，不同種系大鼠的胃對致癌物的易感性不同，有人發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠對MNNG較敏感，雄性大鼠的胃癌誘發(fā)率高于雌性大鼠。不同周齡的大鼠對MNNG較敏感性亦不同，一般幼齡大鼠較成年鼠更敏感，因此，選用2~4月齡、體重100~200g的大鼠較為妥當(dāng)。
（三)實(shí)驗(yàn)方法（experimentalmethod)
1．線結(jié)穿掛法：取小鼠或大鼠，行無菌手術(shù)，在腺胃粘膜面穿掛含甲基膽蒽（MC)的線結(jié)。含MC線結(jié)是用普通細(xì)線，在一端打結(jié)后，將線結(jié)置于盛有MC的玻璃試管內(nèi)，在乙醇燈上微微加熱，使MC液化滲入線結(jié)。一般MC的量為0.05~0.1g,可制10~20根線，每根線結(jié)約含5mg。手術(shù)埋線后大約半個月~1個月即可形成早期浸潤癌，3~4個月誘癌率最高，且誘發(fā)的胃腺癌與人胃癌相似。本校腫瘤研究所（1977)在20-甲基膽蒽誘發(fā)大鼠胃腺癌病理形態(tài)學(xué)動態(tài)觀察中，提出胃癌發(fā)生過程為：MCA→腺胃粘液頸細(xì)胞增殖、分化異常→腸上皮化生→腺瘤性增生或不典型增生→早期癌→浸潤癌。
2．MNNG誘發(fā)法：給藥方法有三種：
（1)連續(xù)給藥法。即從實(shí)驗(yàn)開始至結(jié)束每日給大鼠飲用MNNG溶液，誘癌周期一般需一年或一年半。此法給藥時間持續(xù)，藥物積累多，劑量大，誘發(fā)胃癌的發(fā)生率高，但胃外腫瘤發(fā)生率也較高。Sugimura（1967)用6周齡的雄性Wistar大鼠進(jìn)行研究，用33µg/mlMNNG溶液飲用的12只大鼠366~542天后，有8只在胃腺部發(fā)生腺瘤，4只為胃腺癌。另4只大鼠用83µg/mlMNNG溶液飲用6個月后改用167µg/mlMNNG飼養(yǎng)至371~382天，1只發(fā)生胃腺癌和腺瘤，2只發(fā)生腺瘤，1只為腺瘤伴平滑肌瘤。胃腫瘤主要發(fā)生在幽門區(qū)和胃竇部，腫瘤大小由粟粒斑塊樣到指尖大小的結(jié)節(jié)，并侵及漿膜。但在十二指腸、空腸和近端腸系膜有肉瘤發(fā)生。本校腫瘤研究所應(yīng)用自制合成的MNNG先后成功復(fù)制大鼠胃腺癌（1979)。隨后，用500µg/mlMNNG溶液，采取連續(xù)定量法誘發(fā)Wistar大白鼠胃腺癌病理形態(tài)學(xué)動態(tài)觀察中（1988)，在第84、168、217天分別誘發(fā)出粘膜內(nèi)癌、早期浸潤癌及浸潤癌與多灶性癌（47例胃癌共97個癌灶)，獲得較高誘癌率（47/80)，癌灶大部分位于胃竇，粘膜混濁、灰白或灰黃是胃癌的最早期改變，認(rèn)為胃癌變過程為：MNNG → 粘膜糜爛、缺損 →腺體再生性增生→腺瘤性增生（息肉和腺瘤)或不典型增生→早期癌（粘膜內(nèi)癌和早期浸潤癌)→浸潤癌。同時，誘發(fā)出前胃鱗癌，誘癌率分別高達(dá)58.3%(-12月)、86.7%（-14月)、86.7（-20月)。此外，誘發(fā)胃平滑肌肉瘤13例。
（2)間隔給藥法。有人選用SD系大鼠，用80mg/kgMNNG溶液喂養(yǎng)，每周一次，一共12周。給藥后直至大自然死亡（平均226天)，病理解剖時發(fā)現(xiàn)，腫瘤多發(fā)于前胃（88/89)，胃腺癌發(fā)生率僅3/98。同時發(fā)現(xiàn)30%的大鼠有肝臟退行性改變、局灶性壞死和膽管增生性損害，可能單劑量過大引起。
（3)限期給藥法。即以實(shí)驗(yàn)性開始連續(xù)給藥6~7個月后停藥連續(xù)飼養(yǎng)，直至自然死亡后進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)胃腺癌發(fā)生率達(dá)40%，而連續(xù)飼養(yǎng)同劑量MNNG的大鼠只有16%，說明限期給藥法誘癌率高，專一性強(qiáng)。
大動物中多選用犬制作實(shí)驗(yàn)性胃癌。犬的胃組織結(jié)構(gòu)與人胃相似，可進(jìn)行X線檢查、內(nèi)鏡檢查和活檢，有利于對癌腫的發(fā)展過程、早期診斷、化療效果評價等進(jìn)行研究，但誘癌時間較長，一般要2年或更長的時間，費(fèi)用較高，飼養(yǎng)管理較困難。MNNG化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，不能與食物混合喂養(yǎng)，而且容易誘發(fā)犬腸道平滑肌肉瘤而導(dǎo)致犬死亡。有人介紹用MNNG的乙基衍生物N-乙基-N`-硝基-N-亞硝基胍（ENNG)能成功地誘發(fā)胃印戒細(xì)胞癌，誘癌特異性強(qiáng)，其大體形態(tài)、組織學(xué)分型及腫瘤轉(zhuǎn)移的途徑均與人胃癌相似，并且小腸腫瘤發(fā)生率低。ENNG給藥方法有兩種：①將ENNG制備成1~1.5g/L溶液儲存，給藥時再用自來水稀釋至100~150µg/ml，由犬飲用，容器需避光。給藥150µg/ml6個月或100µg/ml 9個月后停藥，大都在18個月后出現(xiàn)胃癌。②將ENNG溶解在含2%吐溫溶液中，混入犬的固體顆粒飲料中喂食，每日2次，持續(xù)8個月。由于固體食物在胃內(nèi)停留時間較長，能延長藥物與胃粘膜的作用時間，縮短誘癌時間，增加誘癌效果。本校腫瘤研究所分別用MNNG、ENNG誘發(fā)了狗微小胃癌和癌前病變（1985)，發(fā)現(xiàn)胃癌的組織發(fā)生為多中心起源。
二．移植性胃癌模型
移植性腫瘤是指人或動物的腫瘤組織移植到異種或同種動物，傳代后其組織類型、生長特性穩(wěn)定，并能在受體動物身上繼續(xù)傳代成為可移植性瘤株。Rydard(1969) 首次將人結(jié)腸癌皮下移植于免疫缺陷動物裸小鼠獲得成功，開創(chuàng)人鼠異種移植模型的新時代。80年代中期，國內(nèi)外開始用體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞移植于裸鼠皮下，但因長期體外培養(yǎng)過程諸多因素的影響，其生物學(xué)特征與原發(fā)瘤有較大差異。
我校腫瘤研究所（1991)分別將人胃粘液癌和乳頭狀腺癌組織移植于裸鼠皮下，經(jīng)鼠間傳代20代以上，建立了GC－916與GC－915兩株人胃癌裸鼠移植瘤株，經(jīng)病理學(xué)、組織化學(xué)、免疫病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察，證實(shí)裸鼠移植瘤保持了原發(fā)人胃癌的結(jié)構(gòu)和功能，并具有表達(dá)突變型p53、rasp21蛋白及產(chǎn)生CEA的特性。
皮下移植模型雖能保持原發(fā)瘤的組織類型和生化特征，但缺乏人胃癌最典型的轉(zhuǎn)移特性。為了克服這一缺陷，Hoffman（1991)創(chuàng)立了外科原位移植方法，即將新鮮的人腫瘤組織通過手術(shù)原位移植于裸鼠體內(nèi)建立轉(zhuǎn)移鼠模型。此新型模型不但保持原發(fā)瘤組織結(jié)構(gòu)，而且較完整表達(dá)其包括轉(zhuǎn)移在內(nèi)的生物學(xué)行為。因此，它可廣泛用于腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制、抗腫瘤治療及尋找新的腫瘤基因。轉(zhuǎn)移鼠模型無疑是這個領(lǐng)域近年來的重大進(jìn)展，這將預(yù)示每個腫瘤患者都可由其自身腫瘤建立的轉(zhuǎn)移鼠模型作為臨床實(shí)踐標(biāo)準(zhǔn)的新紀(jì)元的到來。
此外，裸鼠體內(nèi)人類器官移植為誘癌實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，如人胚胎氣管、支氣管、鼻咽移植，分別誘發(fā)氣管癌、支氣管癌、鼻咽癌。我校腫瘤研究所（19醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)95)用人胚胎胃粘膜成功移植于裸鼠，并用MNNG誘發(fā)了胃粘膜不典型增生與裸鼠平滑肌肉瘤。
（蘇琦)
第六節(jié) 肝纖維化動物模型
各種損傷因子所致的肝臟損傷，各種疾病引起的慢性肝病，都可使肝臟發(fā)生炎癥、肝細(xì)胞壞死、纖維組織增生進(jìn)而繼發(fā)肝纖維化的病理改變。肝纖維化是指肝細(xì)胞受炎癥刺激及壞死時，肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程，輕者稱為纖維化；重者進(jìn)而使肝小葉結(jié)構(gòu)改建、肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀增生及假小葉形成，稱為肝硬化。生物化學(xué)測定，每克正常肝組織濕重平均有5.5~6.5毫克的膠原，而硬化的肝臟可高達(dá)20毫克以上。
肝纖維化（硬化)動物模型的建立，是開展肝纖維化（硬化)基礎(chǔ)研究及實(shí)驗(yàn)治療研究的重要手段。許多因子可以在實(shí)驗(yàn)動物引起肝纖維化（硬化)。在實(shí)驗(yàn)動物身上施以不同性質(zhì)、不同劑量及不同作用方式的肝毒劑，可造成不同類型的肝纖維化（硬化)模型。按損傷因素和病因分類，主要有下述六種類型，對各種類型的肝纖維化（硬化)動物模型原理及造模方法作一全面的了解，有利于科研中選擇和應(yīng)用較為理想的肝纖維化（硬化)動物模型。
本節(jié)將各種肝纖維化（硬化)動物模型復(fù)制方法分述于下。
一、化學(xué)性損傷模型
（一)CCl4中毒性肝纖維化（硬化)模型
四氯化碳（CCl4)為一種選擇性肝細(xì)胞原漿毒性藥物，其作用機(jī)制為四氯化碳進(jìn)入肝臟后引起肝小葉內(nèi)中央靜脈周圍肝細(xì)胞壞死，繼而引起以肝小葉內(nèi)竇間隙為主的纖維組織增生，通過四氯化碳制備肝纖維化（硬化)模型的途徑有口服、腹腔注射及皮下多點(diǎn)注射等。實(shí)驗(yàn)動物一般采用雄性Wistar大鼠，雌性大鼠肝纖維化形成率低。方法有以下幾類：
1．單純CCl4法：一般采用如花生油、橄欖油等作溶劑制成50%CCl4油劑。0.1~0.3ml/100g體重皮下或腹腔內(nèi)注射，每周2次。肝纖維化形成時間較長，一般在12~15周，動物死亡率也較高。
2．CCl4加苯巴比妥誘導(dǎo)法：于飲水中加入苯巴比妥（300~400mg/L)，同時CCl4蒸氣吸入或灌胃。灌胃方法為：在飲用苯巴比妥2周后，CCl4灌胃，開始劑量為0.04ml，以后按體重增減調(diào)整CCl4用量，每周給藥1次。此法縮短了肝纖維化（硬化)形成時間，早期肝纖維化4~6周形成，8~10周形成肝硬化。動物死亡率仍在40%左右。
3．復(fù)合因子干預(yù)造模：采用高脂低蛋白食物，30%左右的酒精為唯一飲料，皮下注射CCl4（第1次0.5ml/100g體重，以后每隔3天注射40%CCl4油劑0.3ml/100g體重)。實(shí)驗(yàn)第6周末可形成肝硬化。該模型方法簡單，肝硬化形成率高，動物死亡率低。
（二)致癌劑N-乙基亞硝胺（DEN)、二甲基亞硝胺（DMNA)、硫代乙酰胺（TAA)誘發(fā)肝纖維化（硬化)模型
DEN、DMNA是一種具有肝毒性、細(xì)胞毒性和免疫毒性的化合物。
DMNA造模方法為腹腔注射，腹腔每周注射DMNA3次，處理3周，結(jié)果17天即可見肝小葉中央?yún)^(qū)肝細(xì)胞壞死及嗜中性細(xì)胞浸潤，21天可見膠原纖維沉積、局部脂肪變、膽管增生，中央靜脈周圍纖維沉積，此模型與人類肝硬化早期改變的膠原纖維沉積相似，可作為篩選抗纖維化藥物的方便模型。
TAA制備模型的原理是TAA入肝后延長肝細(xì)胞有絲分裂過程，并阻礙RNA從胞核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響依賴酶的代謝過程，最終形成肝細(xì)胞壞死。肝實(shí)質(zhì)的破壞引起間質(zhì)內(nèi)織締組織的生成增多，從而引起纖維組織在局部的沉積，其形成的動物模型在血流動力學(xué)、形態(tài)學(xué)及功能上的改變均與人肝硬化相似。具體方法為用雄性wistar大白鼠，體重130克左右。第一次20mg/100g體重，從第二次起12mg/100g體重，用液體石蠟、橄欖油將CCl4配成40%的溶液每周2次腹腔內(nèi)注射；或飲水中加入0.03%TAA，3個月后100%形成肝硬化，動物死亡率約20%。
二、酒精中毒性和營養(yǎng)性肝纖維化（硬化)模型
酒精引起肝纖維化的主要機(jī)制是：酒精中間代謝產(chǎn)物乙醛對肝臟產(chǎn)生直接損害，其在肝臟使輔酶Ⅰ（NAD)轉(zhuǎn)變?yōu)檫�原性輔酶Ⅰ（NADH)，從而其比值下降，而NAD／NADH比值下降使三羧酸循環(huán)受抑制，進(jìn)而脂肪氧化減弱，肝內(nèi)脂肪酸合成增多，當(dāng)其增多超過肝臟的處理能力就形成脂肪肝，最終形成肝纖維化。
河福金等在大鼠常規(guī)喂養(yǎng)同時灌入酒精（56℃)、橄欖油等的混合液，4周后可見肝小葉中央?yún)^(qū)明顯壞死或呈局灶性壞死、點(diǎn)狀壞死，間質(zhì)可見炎性浸潤，電鏡下可見肝細(xì)胞周圍膠原纖維增生，此類模型可廣泛用于酒精性肝病的研究，依其處于不同的時期可作酒精性脂肪肝及肝纖維化的研究.主要缺點(diǎn)是缺乏穩(wěn)定。
丁霞等采用雄性Wistar大鼠，180~200g體重，每天清早用白酒-玉米油-吡唑混合液灌胃，另外間斷給予高脂飼料（其中酒精攝入量為8~12g/Kg·d，玉米油為2g/Kg·d，吡唑?yàn)?4mg/Kg·d)，造模時間為12周�？梢姴煌愋偷淖冃�、壞死及膠原纖維增生，均有肝纖維化形成，但程度不一。
三、免疫性肝纖維化（硬化)模型
1．用異種血清制品建立肝纖維化模型，其主要原理是異種血清進(jìn)入體內(nèi)引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，在肝臟主要是在門脈匯管區(qū)及中央靜脈周圍形成免疫復(fù)合物沉積，由沉積的免疫復(fù)合物引起局部炎性反應(yīng)，進(jìn)一步刺激膠原的增生而形成肝纖維化，并見匯管區(qū)主要分布肌成纖維細(xì)胞。
方法為：雄性Wistar大鼠，體重120~150克。尾靜脈攻擊注射異種人血清白蛋白，2次/周，第一周2~3mg/只，以后每次攻擊增加0.5mg，直至4.5mg。維持此量，至少2月。攻擊后60天纖維化達(dá)到最大限度且纖維化持續(xù)時間達(dá)260天以上。肝纖維化形成率約為85%。建立免疫性肝纖維化（硬化)動物模型，對于研究肝纖維化（硬化)的產(chǎn)生機(jī)制、早期診斷及評價藥物療效，是一種極有用的肝纖維化模型。
2．用細(xì)菌菌體成份建立肝纖維化模型，大鼠腹腔內(nèi)注射鏈球菌胞壁提取物，可引起門脈區(qū)周圍肉芽腫，為T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答損傷所致的肝纖維化，可用于研究肝纖維化過程中巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及其它細(xì)胞及這些細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的作用。
四、總膽管結(jié)扎致肝纖維化（硬化)模型
其作用原理是形成人為的肝外膽道梗阻，從而引起梗阻部位以上膽管擴(kuò)張、膽汁淤積、膽道內(nèi)壓力增高，并可引發(fā)肝內(nèi)膽小管擴(kuò)張破裂，由于肝內(nèi)血管受到擴(kuò)張膽管的壓迫及膽汁外滲，肝細(xì)胞會發(fā)生缺血和壞死，纖維組織向膽管間伸展，包圍肝小葉并散布于肝細(xì)胞周圍，最終形成肝硬化。
動物選用健康的成年雜種狗，雌雄均有，體重12~21Kg。術(shù)前禁食12小時，戊巴比妥30mg/Kg靜脈麻醉，上腹正中切口，分離總膽管2~3cm，近十二指腸處和近膽囊處各扎兩道，從中切斷膽總管。6~10周即可建立肝纖維化（硬化)模型。
由于造成的是完全性梗阻，所以建立模型的時間相對較短。該模型的肝功能試驗(yàn)異常及病理組織學(xué)所見，與人類小結(jié)性肝硬化的生化及組織學(xué)變化相似。
五、生物學(xué)模型
（一)蟲卵致肝纖維化（硬化)模型
小鼠、家兔等動物感染血吸蟲所致的肝纖維化（硬化)模型，病變特殊，可用于研究血吸蟲病性肝纖維化（硬化)，但不適于其他類型的肝纖維化（硬化)。
小鼠皮下注射曼氏血吸蟲尾蚴后，門脈區(qū)寄生蟲卵沉積引發(fā)免疫反應(yīng)產(chǎn)生炎癥，6~8周肝纖維化形成，10~20周后形成肝硬化。肝臟膠原量可增加至正常的20倍，白蛋白合成也受抑制。
（二)病毒致肝纖維化（硬化)模型。
我國的肝纖維化大都繼發(fā)于病毒性肝炎。因此，用鴨乙肝病毒（DHBV)感染鴨來制作病毒性肝炎肝纖維化（硬化)模型，有益于對病毒性肝炎肝纖維化（硬化)的肝纖維化機(jī)制和藥物治療的研究。
造模成功與否的主要因素有：（1)鴨種：北京鴨較為敏感。（2)DHBV接種劑量：7.5×107~5×109之間。（3)接種途徑：包括靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、胚內(nèi)注射，其中靜脈注射感染率可達(dá)100%。（4)接種時機(jī)：孵出后24小時內(nèi)接種最佳，此時，鴨免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善。
方法舉例：60~90g體重的1日齡櫻桃谷鴨（英國鴨與北京鴨雜種)，經(jīng)脛靜脈注射鴨乙肝病毒0.1ml/只（含DHBV顆粒2.5×109)。80天可見纖維組織輕度增生，100天纖維組織中度增生，112天約10%發(fā)生肝纖維化，約5%發(fā)生肝硬化。
（三)復(fù)合因素所致肝纖維化（硬化)模型
由于單因素造模時間長，成模率低，單一因素加大劑量不能提高肝纖維化水平，反而動物死亡率增高；復(fù)合因素造模，時間短，成模率高。
有CCl4與乙醇聯(lián)合使用，CCl4與苯巴比妥、亞硝基胺合用，CCl4與DMNA合用，乙醇與飽和脂肪酸或植物油、葡萄糖合用等等。如CCl4與DMNA合用，肝纖維化時間可縮短至42天，且該模型可用于研究肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化的機(jī)理。
肝纖維化（硬化)模型種類繁多，理想的肝纖維化模型需要符合以下特征：復(fù)制人肝纖維化（硬化)的病變模型；病理改變呈階段性進(jìn)展；模型制作的可重復(fù)性高且死亡率低；肝纖維化應(yīng)具有可逆性和不可逆性病變過程；病理生理上一系列的病變過程與人類的相似。
總體上動物肝纖維化（硬化)模型能與人的肝纖維化（硬化)有形態(tài)學(xué)、血液動力學(xué)及生化方面相似的特點(diǎn)，但到目前為止沒有與人肝纖維化（硬化)完全相似的模型，可能與人和動物之間的種屬差異有關(guān)，但仍可依據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x取相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動物模型。
（朱建思)
第七節(jié) 呼吸衰竭動物模型
呼吸衰竭是由導(dǎo)致外呼吸功能發(fā)生嚴(yán)重障礙的疾病所引起，也是這些疾病發(fā)生發(fā)展過程中導(dǎo)致病人死亡的重要原因。根據(jù)PaO2降低或PaCO2是否升高，可將呼吸衰竭分為低氧血癥型(Ⅰ型) 和高碳酸血癥型(Ⅱ型) ，按發(fā)病機(jī)制不同，可分為通氣性和換氣性呼吸衰竭，因原發(fā)病變部位不同，可分為中樞性和外周性呼吸衰竭，根據(jù)病情的急緩分為急性和慢性呼吸衰竭。呼吸窘迫綜合征（Respiratory distress syndrome,RDS)是臨床上較常見的一型急性呼吸衰竭，于1967年由Ashbaugh首先提出，其臨床特征為：進(jìn)行性的呼吸困難和低氧血癥，常繼發(fā)于休克、創(chuàng)傷、燒傷、膿毒血癥、氧中毒等多種病理過程。目前，利用實(shí)驗(yàn)動物復(fù)制RDS模型的方法有多種，如給予動物靜脈注射油酸、甘油三脂、內(nèi)毒素或吸高濃度氧、失血性休克等，本節(jié)主要介紹一種用動物異體骨髓提取液靜脈注射的方法復(fù)制RDS模型。
一、動物
大鼠、家兔、家犬、豬等動物均可用于復(fù)制RDS模型，且不拘雌雄和品系，因大鼠和家兔體格小，提取骨髓較麻煩，而從家犬和豬提取骨髓較容易。
二、方法
（一)犬骨髓提取液的制備：
取犬新鮮長骨，刮除骨膜外組織，75%乙醇消毒后劈開。將劈開的長骨放入乙醚中洗出骨髓腔的骨髓，然后，用普通濾紙過濾，清除碎骨和組織等有形成份。骨髓與乙醚混合物放于燒杯中，加蓋濾紙防塵，在常溫下乙醚經(jīng)48小時充分揮發(fā)后，得清亮微黃骨髓提取液，置冰箱備用。豬骨髓提取液制備方法與此相同。
（二)模型復(fù)制步驟
1．選取健康雜種犬或小型豬，體重4~8kg左右，雌雄不拘，以3%戊巴比妥鈉1ml/kg靜脈麻醉。頸部手術(shù), 作氣管插管, 分離頸總動脈和頸外靜脈。
2．從右側(cè)頸外靜脈插入漂浮導(dǎo)管經(jīng)右心房、右心室至肺動脈以備測肺動脈楔壓(PAP)，從左側(cè)頸總動脈插入普通導(dǎo)管至主動脈以備測主動脈壓(Aortic presure，AP)。
3． 從左側(cè)頸外靜脈注入加溫至38．C的骨髓提取液，注射量按0.6ml/kg計算。緩慢注射歷時1~2分種左右。
4． 注射骨髓提取液前后，全程監(jiān)測主動脈壓和肺動脈楔壓。每小時測一次主動脈血pH 、Pa O2 、 和PaCO2 并計算肺泡－動脈氧分壓差(A-aDO2)。
（三)模型復(fù)制結(jié)果判定
1．呼吸變化
動物在靜脈注入骨髓提取液后，10分鐘內(nèi)均表現(xiàn)出呼吸加深加快，1小時后，呼吸頻率可達(dá)正常頻率的3~4倍，3小時后呼吸頻率開始趨緩，可有明顯的吸氣性呼吸困難。
2．血?dú)夂虯-aDO2 變化
靜脈注入骨髓提取液后，PaO2開始逐漸下降，1小時后 PaO2可低于60mmHg，而pH與PaCO2無明顯變化，但可見pH稍偏高，PaCO2稍偏低。A-aDO2 正常值在海平面呼吸空氣的條件下為10~30mmHg，差值增大說明肺泡氧彌散功能發(fā)生障礙，這是判定RDS的主要依據(jù)。RDS時因肺水腫、充血、出血等病變使肺通氣/血流比值改變，導(dǎo)致的嚴(yán)重低氧血癥不能單純用提高吸入氧分?jǐn)?shù)(FiO2) 糾正。
A-aDO2計算公式：
A-aDO2=［（大氣壓－水蒸氣壓)×吸入氣氧濃度－（PaCO2÷呼吸商)］－PaO2＝
［（760－47)×0.21－（40÷0.8)］－PaO2＝98－PaO2
3．PAP與AP
靜脈注入骨髓提取液后，PAP快速升高并持續(xù)穩(wěn)定在較高水平，3小時后再次開始緩慢升高。AP無明顯變化。
4．肺病理形態(tài)變化
肺體積和重量增加使肺系數(shù)增大［肺系數(shù)＝肺重量(g)÷體重(kg) ］。鏡檢可見肺水腫、肺出血、微血栓、肺間質(zhì)炎性浸潤和增厚、肺透明膜形成。部分肺泡萎陷，部分肺泡呈代償性擴(kuò)張。
骨髓提取液中含有軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、豆冠酸、花生酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等成分，此外，還有一些未測成分。用骨髓提取液復(fù)制RDS模型，在發(fā)病原因上較單純用油酸、甘油三酯更接近于嚴(yán)重擠壓傷或骨折時機(jī)體大量釋放脂質(zhì)所致RDS，其引起RDS發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制為骨髓栓塞肺毛細(xì)血管造成肺微循環(huán)障礙。
(金海燕)
第八節(jié) 多器官功能障礙綜合征動物模型
多器官功能障礙綜合征（MODS)主要是指嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克期間或復(fù)蘇后，同時或者相繼出現(xiàn)兩個或兩個以上器官功能障礙。在MODS發(fā)病過程中還出現(xiàn)失控的全身炎癥、高代謝狀態(tài)、高動力循環(huán)等全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS)及免疫功能失調(diào)。MODS可以逆轉(zhuǎn)，并且可以不遺留器官損傷的痕跡，也不復(fù)發(fā)。但迄今為止其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，早期診斷較為困難，缺乏行之有效的防治手段，發(fā)病率和病死率居高不下。因此，闡明MODS的概念和發(fā)病機(jī)制，找出早期診斷的指標(biāo)和防治方法，具有重要的理論價值和實(shí)踐意義。
一、單向速發(fā)型MODS動物模型
（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
模擬多器官功能障礙綜合征（MODS)的致病因素、發(fā)病過程和臨床特征，研究MODS的發(fā)病機(jī)理及其防治措施
（二)實(shí)驗(yàn)動物
Wistar大鼠，200~300克，性別不拘。
（三)藥品、器材
酵母多糖粉劑（zymosan A,Sigma公司)、醫(yī)用石蠟、3%戊巴比妥鈉、無菌生理鹽水、無菌林格氏液等。高頻磁力攪拌器，注射器等。
含酵母多糖石蠟液的配制：將酵母多糖粉劑1克加入20毫升醫(yī)用石蠟中，用高頻磁力攪拌器混勻制成懸液，置100oC水浴中消毒后備用。
（四)實(shí)驗(yàn)步驟
動物分為三組，實(shí)驗(yàn)組、石蠟對照組和正常對照組。實(shí)驗(yàn)組動物腹腔注射含酵母多糖石蠟液1.5~2ml /100g體重，石蠟對照組動物腹腔注射醫(yī)用石蠟液1.5~2ml /100g體重，正常對照組動物腹腔注射無菌生理鹽水1.5~2ml /100g體重。實(shí)驗(yàn)組與石蠟對照組動物于實(shí)驗(yàn)第一天腹腔補(bǔ)充無菌生理鹽水10ml /100g體重，第二天補(bǔ)充5ml /100g體重，第三天及第四天分別補(bǔ)充2.5~1.25ml /100g體重。分別于第二天和第五天放血或斷頭處死動物，處死前左心室取血檢測PaO2 、GPT、 Cr，處死后取主要臟器作大體檢查和常規(guī)石蠟切片作光鏡檢查，必要時作常規(guī)透射電鏡制樣，用作超微結(jié)構(gòu)觀察。
（五)結(jié)果判定
注射酵母多糖動物第2天，平均動脈壓明顯降低，尿量顯著減少，血肌酐及谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，嗜睡、反應(yīng)低下，門靜脈和肝靜脈血培養(yǎng)陽性率顯著高于對照組；具有明顯SIRS的表現(xiàn)，病理改變主要為各臟器組織水腫、出血和炎癥細(xì)胞浸潤，可見實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性、壞死、脫落，部分動物在2天內(nèi)死亡。至第5天，上述病變有所減輕。
此模型較易復(fù)制，死亡率較低（33%左右)，有明顯的SIRS和多器官損害。其中以肺臟發(fā)生最早、最嚴(yán)重。但致病因素與臨床有一定差距。本模型適用于發(fā)病機(jī)制研究。
二、雙相遲發(fā)型MODS動物模型
（一)鼠雙相遲發(fā)型MODS模型
1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
模擬多器官功能障礙綜合征（MODS)的致病因素、發(fā)病過程和臨床特征，研究MODS的發(fā)病機(jī)理及其防治措施。
2．動物與分組
Wistar大鼠，體重200~300克，性別不拘。
3．藥品、器材
大腸桿菌內(nèi)毒素（E.Coli O55B5)，3%戊巴比妥鈉，無菌林格氏液，動、靜脈插管，輸血、輸液器材，注射器等。
4．實(shí)驗(yàn)步驟
動物術(shù)前12小時禁食，戊巴比妥鈉3mg/100g體重腹腔麻醉。行一側(cè)頸動、靜脈分離與插管，動脈插管用于檢測血壓和放血。動物分為三組，首次打擊組采用失血性休克和再灌流損傷。按Wigger’s法在3分鐘內(nèi)快速放血，使平均動脈壓迅速降至4kPa (30mmHg ),然后緩慢放血，使平均動脈壓維持在4~4.7kPa (30~35mmHg )，持續(xù)2小時。之后將全部放出的血液及其1倍容量的林格氏液經(jīng)頸靜脈快速回輸（15分鐘內(nèi)完成)，造成缺血-再灌注損傷。首次加第二次打擊組在復(fù)蘇后6小時實(shí)施第二次打擊。第二次打擊組不作前述處理，僅從腹腔1次性注射大腸桿菌內(nèi)毒素（E.Coli O55B5)2mg /100g體重，造成腹膜炎和膿毒癥。注射后4小時，經(jīng)腹腔補(bǔ)充林格式液5ml /100g體重。整個實(shí)驗(yàn)觀察72小時。
5．結(jié)果
動物有SIRS表現(xiàn)，首次加第二次打擊組心、肝、腸等臟器功能障礙發(fā)生率約為50%，死亡率大于30%，而首次打擊組和第二次打擊組基本不出現(xiàn)MODS。
本模型損傷因素和發(fā)病過程均與臨床接近，適合于SIRS或雙相遲發(fā)型MODS機(jī)理及防治方面的研究。
（二)標(biāo)準(zhǔn)化的MODS模型
1．實(shí)驗(yàn)動物
1年齡的雄性山羊，體重25公斤左右。
2．藥品、試劑
大腸桿菌內(nèi)毒素（O26B6), 3%戊巴比妥鈉，林格式液，10%脂肪乳劑和葡萄糖液，復(fù)合氨基酸等。
3．動物ICU的建立
基本設(shè)備：1)心功能監(jiān)護(hù)儀：能進(jìn)行全套血流動力學(xué)監(jiān)測 2)多功能呼吸機(jī)：能監(jiān)測呼吸頻率、潮氣量、氣道阻力、肺順應(yīng)性、吸入氧濃度，并具備PEEP功。 3)輸液泵和注射器泵：用于循環(huán)治療。4)氧氣管道用于氧療。5)負(fù)壓吸引裝置，用于吸痰和胃腸減壓。6)動物代謝籠和動物固定裝置。7)具有空調(diào)、凈化和通風(fēng)設(shè)備。
4．實(shí)驗(yàn)步驟
模型復(fù)制分為受次打擊（手術(shù)創(chuàng)傷+失血性休克+復(fù)蘇再灌流)、二次打擊（門靜脈內(nèi)毒素血癥)和器官支持三個階段。動物分為首次打擊組、二次打擊組、首次+二次打擊組。山羊用戊巴比妥鈉30mg/kg體重腹腔麻醉，頸部手術(shù)行氣管插管、頸總動脈、頸靜脈和肺動脈插管。上腹正中切口，自腸系膜上靜脈插管至門靜脈，監(jiān)測門靜脈血流量（PVF)，作胃和回腸造瘺置入胃腸粘摸張力計監(jiān)測胃和小腸粘摸pH (pHi )；首次打擊組術(shù)后20分鐘采用Wiggers法造成失血性休克，平均動脈壓維持在6.0~7.3kPa 1小時。之后經(jīng)靜脈和門靜脈快速輸回放出的血液及其2倍容量的林格氏液。此時，MAP和心臟指數(shù)（CI)均能恢復(fù)至休克前的80%以上；第二次打擊組于復(fù)蘇后24小時經(jīng)門靜脈持續(xù)輸入大腸桿菌O26B6內(nèi)毒素30ng /kg·min ，持續(xù)5天。
器官功能監(jiān)護(hù)和支持：進(jìn)行持續(xù)呼吸和循環(huán)功能監(jiān)護(hù)，當(dāng)心血管或/和呼吸功能不全達(dá)到1分（見后)時，施行機(jī)械通氣或/和輸入多巴胺維持血壓。整個實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行代謝監(jiān)測和標(biāo)準(zhǔn)代謝支持，熱卡按2倍基礎(chǔ)能量消耗（山羊?qū)崪y為85.8±3.9k/kg.·d)，靜脈輸入復(fù)合氨基酸、10%脂肪乳劑和葡萄糖溶液補(bǔ)給。補(bǔ)充蛋白質(zhì)1.45g/kg·d，熱卡與氮的比例為 2180：1，常規(guī)補(bǔ)鉀1。5/d ，水100~150ml/kg·d。
5．檢測指標(biāo)
（1)炎癥介質(zhì)：測定TNF、IL-6、IL-8等；
（2)器官功能：測定血?dú)夂托摹⒏�、腎以及血液酶學(xué)或生化指標(biāo)；測定門靜脈血二胺
氧化酶（DAO)、小腸pHi以及尿中乳果糖與甘露醇排除量的比值作為評價腸屏障功能的參考；
（3)血細(xì)菌培養(yǎng)、內(nèi)毒素測定和臟器細(xì)菌定量；
（4)物質(zhì)代謝：測定血葡萄糖、游離脂肪酸、尿三甲基組氨酸和全血乳酸含量；
（5)血流動力學(xué)：用心功能監(jiān)護(hù)儀測定并計算體循環(huán)、肺循環(huán)和門靜脈血流動力學(xué)和氧代謝指標(biāo)；
（6)病理形態(tài)學(xué)檢查。
本模型為標(biāo)準(zhǔn)化的MODS動物模型，最大限度地模擬臨床MODS的病因、發(fā)病過程和功能、代謝變化，是研究MODS發(fā)病機(jī)制及其防治的好的動物模型。
表15-2 動物SIRS的診斷依據(jù)
| 指 標(biāo) 診 斷 依 據(jù) |
| 直腸溫度 >或<對照值1ºC 呼吸頻率 >對照值×2或PaO2< 對照值的75% 心 率 >對照值×1.5 白 細(xì) 胞 總數(shù)>對照值×2或<對照值的50%，分葉核總數(shù)>10% 血流動力學(xué) 高心排出量，低外周阻力 氧 代 謝 耗氧量和二氧化碳排出量增加 炎癥介質(zhì) 血漿急性期蛋白和炎癥介質(zhì)含量（主要為TNF、IL-1、IL-6、PLA2)增加 細(xì)菌、內(nèi)毒素 血細(xì)菌培養(yǎng)陽性，血中內(nèi)毒素含量增加 病理改變 多臟器組織呈炎性改變 |
表15-3動物MODS時器官功能障礙分期診斷及評分標(biāo)準(zhǔn)
| 受累器官 | 功 能 障 礙 | ||
| I期（1分) II期（2分) III期（3分) | |||
| 肺 | 呼吸窘迫，頻率≥2倍對照值；吸空氣PaO2≤9.3kpa，>7.98kPa;PaO2/FiO2≥39.9kPa;以上三項(xiàng)中具備兩項(xiàng) | 吸空氣PaO2≤7.98kPa,>6.60kPa;PaO2/FiO2≤39.9 kPa,>26.6 kPa;(A-a)O2(FiO21.0)>13.3 kPa, ≤26.6;以上三項(xiàng)中具備兩項(xiàng) | PaO2/ FiO2≤26.6 kPa；PaCO2≥5.98kPa;P（A-a)O2(FiO21.0)>26.6 kPa;以上三項(xiàng)中具備兩項(xiàng) |
| 胃腸 | 腹部脹氣，腸鳴音減弱，胃腸pHi≤7.1，>7. 0；血D-乳酸酸或L/m≥1.5倍對照值，以上四項(xiàng)中具備兩項(xiàng) | 高度腹部脹氣，腸鳴音消失，胃腸pHi≤7.0以上三項(xiàng)中具備兩項(xiàng) | 麻痹性腸梗阻，應(yīng)激性潰瘍出血 |
| 心血管 | 無血容量不足，心動過速≥2倍對照值；MAP持續(xù)≤9.3kpa,>7.98kpa | 心動過速，CPK或LDH>3倍對照值；無血容量不足，MPA≤7.98kPa,>6.65kPa;（需升壓藥維持血壓) | 心律紊亂，心率<60/min； |
| 肝 | 血TB或GPT≥2倍對照值，<3倍對照值 | TB或GPT≥3倍對照值； | MAP<6.65 kPa；對升壓藥失去反應(yīng) |
| 腎 | 血Cr>2倍對照值和/或FENa>2.5 | 血Cr>3倍對照值和/或FENa>4.0 | |
| 凝血 | 血小板≤80×109/L,>50×109/L，PT及TT比對照延長≤3秒 | PT或TT比對照值延長>3秒，血小板≤50×109/L | |
| 腦 | 昏迷僅對疼痛刺激有反應(yīng) | 對疼痛刺激無反應(yīng) |
注：P（A-a)O2:肺泡動脈氧分壓差；pHi：粘膜內(nèi)pH值；L/M：尿中乳果糖與甘露醇排出量的比值；FENa；濾過鈉排泄分?jǐn)?shù)；GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶
（馮大明)
