除完整的細胞可作為抗原外，各種不同的細胞內(nèi)存在的各種分子量不同的物質(zhì)，也都具有全抗原或半抗原的性質(zhì)，某種抗原物質(zhì)可能是某一類細胞所特有的，可作為這種細胞的一個標志。由于細胞存在著許多性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，有時要從這眾多的物質(zhì)中提取、純化某種抗原物質(zhì)，以供科學(xué)研究之用。
一、抗原的提取
抗原的制備是一件十分細致的工作，要制備一個高純度的抗原，需要付出艱巨的努力，制備工作涉及物理學(xué)、化學(xué)和生理學(xué)等許多領(lǐng)域的知識。根據(jù)物理或化學(xué)特性建立起來的分離、純化方法的主要原理不外乎科二個方面：①利用混合物中幾個組分分配率的差別將他們分配到可用機械方法分離的兩或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑抽提、層析和結(jié)晶等；②把混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同的區(qū)域而達到分離的目的，如電泳、超速離心和超濾等。由于組織細胞內(nèi)存著許多分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，其分離方法也不一樣，就是同一類大分子物質(zhì)，因選材不同，所使用的方法也很大差別。因此很難有一個通用的標準方法供提取任何生物活性物質(zhì)使用，所以在提取前必須針對所欲提取的物質(zhì)，充分查閱文獻資料，選用合適的方法。如果要提取一個結(jié)構(gòu)及性質(zhì)未知的抗原物質(zhì)，更需要經(jīng)過各種方法的比較探索，才能找到一些工作規(guī)律和獲得預(yù)期的效果。
抗原物質(zhì)的制備，大概要經(jīng)過如下過程：①材料的選擇和預(yù)處理；②細胞的粉碎（細胞器的分離)。③提取；④純化；⑤濃縮或干燥，保存�，F(xiàn)分別簡述如下。
�。ㄒ�)材料的選擇及預(yù)處理
選擇什么材料主要根據(jù)實驗?zāi)康亩āＭǔ＿x含量高、工藝簡便、成本低的材料。材料選定后，通常要進行預(yù)處理，剔除結(jié)締組織、脂肪組織等，把組織塊剪碎。若取材后不立即進行提取，則應(yīng)冷凍保存，動物組織更要深低溫保存。某些容易失活的物質(zhì)，一般宜采用新鮮材料。
�。ǘ�)細胞的粉碎
除了提取體液、組織間液內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)、酶不需粉碎細胞外，凡要提取組織內(nèi)、細胞膜上及胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)，都必須把組織和細胞粉碎，使活性物質(zhì)充分釋放到溶液內(nèi)。不同的組織，細胞的破碎難易不一，因此所使用的粉碎方法也不完全相同。如腦、胰、肝等比較軟嫩的組織，用普通勻漿器研磨就行，肌肉、心臟等則需絞碎后再作勻漿�，F(xiàn)漿常用的細胞粉碎方法介紹如后。
1．物理法
�。�1)高速組織搗碎機：通常由調(diào)速器、支架、馬達、帶桿刀葉、有機玻璃筒等組成。把材料放于筒內(nèi)（約占筒內(nèi)容積的1/3)固定筒蓋，開動馬達，調(diào)速器由慢逐漸增至所需速度。此法適用于內(nèi)臟組織。
（2)玻璃勻漿器：由一個內(nèi)壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（球面經(jīng)過磨砂)玻璃研桿組成。把絞碎的組織置于管內(nèi)，加適量溶液，插入研桿，用手或電動轉(zhuǎn)動研桿，并上下移動。用此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機高，對大分子的破壞也少。是粉碎少量軟嫩材料（腦、胰、肝等)時常用的方法。
�。�3)超聲波處理法：多用于軟嫩組織，根據(jù)不同組織采用不同頻率，處理10～15min，超聲波處理時溶液溫度升高，使不耐熱的物質(zhì)失活，使用時為防止溫度升高，除間歇開機外，還需人工降溫，避免溶液內(nèi)存在氣泡。核酸及某些酶對超聲波很敏感，要慎用。
�。�4)反復(fù)凍融法：把待碎樣品冷卻到零下15～20。C，凍固后取出，緩慢解凍，如此反復(fù)操作，可使大部分動物性細胞及胞內(nèi)的顆粒破碎，但也可使生物活性物質(zhì)失活。
�。�5)冷熱交替法：把材料投入90。C左右水中維持數(shù)分鐘后取出投入冰浴內(nèi)，可使大部分細胞破碎�？捎糜谔崛〉鞍踪|(zhì)和核酸。
2．化學(xué)和生物化學(xué)法
（1)自溶法：把新鮮材料置于一定的pH和適宜的溫度下，利用組織細胞自身的酶系統(tǒng)把組織破壞，使細胞內(nèi)容物釋放出來。動物材料的自溶溫度選在0～4℃，需加少量防腐劑，自溶時間較長，不易控制，不常用。
（2)溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細胞壁。在每毫升含2億個細胞的懸液中加100μg至1mg溶菌酶，37℃，保溫10min，細胞就破壞了。此外，蝸牛酶、纖維素酶也被選作破碎細菌細胞之用。
（3)表面活性劑處理法：較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。
�。ㄈ�)抗原的提取
提取、抽提、萃取這3個詞的含義基本相同。但一般說來，提取是指在分離純化前期，將經(jīng)過處理或粉碎了的細胞置于一定條件和溶劑中，讓被提取物充分地釋放出來的過程，而抽提則是貫穿于分離純化的整個過程中，如在制備核酸過程中，用氯仿反復(fù)提取蛋白液，用苯酚反復(fù)抽提分離DNA和RNA。影響提取的因素主要來自被提取物在提取的溶劑中的溶解度大小以及它由固相擴散到液相的難易。一個物質(zhì)在某一溶劑中的溶解度大小和該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用的溶劑的理化性質(zhì)有關(guān)。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性大分子的等電點遠的pH值使溶解度增加。因此，在不同的抗原提取過程中，所選用的溶劑的性質(zhì)、pH值、離子強度、抽提溫度、介電常數(shù)等因素是提取成敗的重要因素。要達到分離提純的目的，必須靈活地應(yīng)用這些因素。
現(xiàn)將蛋白質(zhì)、核酸、多肽等抗原（半抗原)的提取方法概要敘述于下。
1．蛋白質(zhì)和酶的提取 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸連接而成的高分子物質(zhì)，分子量從數(shù)千至百萬。數(shù)以千計的蛋白質(zhì)，按它們的功能可分成兩大類，一類是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、受體蛋白、運動蛋白、運輸和貯存蛋白、防御蛋白等等，另一類是非活性蛋白，如膠原蛋白、角蛋白等，不同的蛋白質(zhì)由于其結(jié)構(gòu)的差異，它們?nèi)芙舛纫哺鞑幌嗤�。大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于有機溶劑乙醇、丙酮、丁醇等。這對選擇撮蛋白質(zhì)的溶劑具有重要意義。
�。�1)水溶液提�。河捎诘鞍踪|(zhì)大部分溶于水、稀酸和稀堿溶液，因此提取蛋白質(zhì)以水溶液為主，其中尤以稀鹽液和緩沖液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好，溶解度大，氫是最常用的溶劑。應(yīng)注意下列幾點：①鹽濃度，常用等滲溶液，尤以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液、0.15mol/L氯化鈉溶液應(yīng)用較多。如酵母脫氫酶以0.66mol/L磷酸氫二鈉溶液提取，6-磷酸葡萄糖脫氫酶以0.1mol/L碳酸氫鈉液提取，脫氧核糖核蛋白在低鹽溶液中溶解度小，就要用1mol/L以上的氯化鈉液提取，而某些脂肪酶，用水提取比低鹽溶液提取效果更好。②pH值的選擇對蛋白質(zhì)提取頗為重要，因為蛋白質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性與pH值關(guān)系很大。提取液的pH值首先要保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范疇內(nèi)，通常在等電點的兩側(cè)，堿性蛋白如細胞色素C和溶菌酶選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶應(yīng)選在偏堿一側(cè)。③溫度：為防止活性蛋白變性、降解而失活，溫度通常選在5℃以下。對少數(shù)耐溫的蛋白質(zhì)和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離，有利于提純，如胃蛋白酶、酵母醇脫氫酶以及許多多肽激素可選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。醫(yī).學(xué) 全在.線提供www.med126.com
（2)有機溶劑提�。阂恍┎蝗苡谒�、稀鹽、稀酸或稀堿溶液的蛋白質(zhì)和酶，常用不同比例的有機溶劑來提取。如用70%～80%乙醇提取麩蛋白；用60%～70%的酸性乙醇提取胰島素，既可抑制水解酶對胰島素的破壞，又可除去大量雜蛋白，用丁醇提取某些附于微粒體和線粒體的酶，一些與脂質(zhì)結(jié)合牢固的蛋白質(zhì)和酶以丁醇提取，效果較好。我國生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脫氫酶和堿性磷酸脂酶。丁醇提取法對pH及溫度的選擇范圍較廣（Ph3～10),溫度由零下2℃～40℃均可。
2．核酸的提取 核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（RNA)，另一類為脫氧核糖核酸（DND)。核酸的分子量極大，人數(shù)萬致億萬。核酸是兩性化合物，在一定的等電點。溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有機溶劑。細胞內(nèi)的核酸常和蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質(zhì)溶液中的溶解度有顯著區(qū)別，有一定濃度范圍的氯化鈉溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度隨著氯化鈉濃度增加而逐漸下降，當氯化鈉濃度為0.14mol/L時，其溶解度僅為水中溶解度的1/100，但當氯化鈉濃度再增加時，脫氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化鈉濃度增加到0.5mol/L時，其溶解度與水中溶解度相似，當氯化鈉濃度增加到1mol/L時，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化鈉溶液中仍有相當大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化鈉溶液提取核糖核蛋白，而提取脫氧核糖核蛋白時，則用1mol/L氯化鈉溶液。兩種核糖核蛋白的溶解度與溶液的pH也有關(guān)。當pH為4.2時，脫氧糖核蛋白的溶解度最低，而pH為2.0～2.5時，核糖核蛋白的溶解度最低。所以調(diào)節(jié)氯化鈉溶液的濃度和pH值，可使核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白分離開來。
�。�1)RNA的提�。篟NA在細胞中主要有三種類型，即rRNA（核微粒核糖核酸)、tRNA（轉(zhuǎn)移核糖核酸)和mRNA（信使核糖核酸)。mRNA代謝極不穩(wěn)定，提取時要求條件較嚴格；tRNA當細胞破碎后，用酸處理得到“pH5”沉淀，即可從中分離tRNA；rRNA占全部RNA的80%以上，比較穩(wěn)定，一般提取的大分子RNA主要為此部分。核內(nèi)rRNA常先將細胞核分離后，再進行提取，可避免其他細胞組分RNA的干擾。
RNA的提取，通常是用0.14mol/L氯化鈉溶液將組織做勻漿并反復(fù)提取細胞質(zhì)中的核糖核蛋白，而留下含有DNA的細胞核物質(zhì)，然后用10%醋酸調(diào)至pH4.2沉淀，離心棄去上清液，先用0.5mol/L氯化鈉溶液，后用水洗滌沉淀，將核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氫鈉溶液中，離心，取上清液，調(diào)pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌，再一次除去脫氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白質(zhì)可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氫鈉水溶液中，加入乙醇，RNA即以鈉鹽形式沉淀出來。
提取RNA另一類方法，不須事先用0.14mol/L氯化鈉提取核糖核蛋白，而一步將RNA的蛋白質(zhì)分開，并同時把RNA抽提出來，此類方法是在破碎細胞做成勻漿時，加入去污劑十二烷基磺酸鈉或二甲苯磺酸鈉；而現(xiàn)在最常用的方法是直接加入含水苯酚與勻漿一起振蕩，DNA和蛋白質(zhì)沉淀于酚層中，水層中含RNA和多糖，然后用乙醇使RNA沉淀，四種物質(zhì)一步便可初步分離開。苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法，其應(yīng)用舉例如下：
肝臟rRNA的提取：按肝重（鮮)加入10倍容積苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸餾水中，另加入0.5g 8-羥基喹啉配成)及10倍容積的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/V)做勻漿后在20℃攪拌20min。
肝臟細胞核內(nèi)mRNA的提�。合确蛛x細胞核，再將核懸浮于3倍容積的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液（g/V)中勻漿后加入等量90%（g/V)苯酚水溶液（內(nèi)含0.1%8-羥基喹啉)在2℃振蕩提取30min。
酵母tRNA的提�。�100g酵母（濕重)加入200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振蕩2h,4℃冰箱中過液，使之提取完全。
以上介紹了用冷酚法提取各種RNA的一些實例，近來還有皂土酚法（即除苯酚外還加入皂土吸附蛋白質(zhì))提取RNA，據(jù)報道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但應(yīng)用苯酚法提取核酸時，須注意市售苯酚常含有少量重金屬和雜質(zhì)，可能導(dǎo)致核酸降解，使用時，一般需要減壓重蒸。
（2)DNA的提�。篋NA主要存在于細胞核中，天然狀態(tài)的DNA絕大多數(shù)是以脫氧核糖核蛋白形式存在。人細胞中提取DNA時，一般先獲得脫氧核糖核蛋白，再將蛋白質(zhì)除去，從中分離DNA。常用的方法是以1mol/L氯化鈉溶液抽提，得到的脫氧核糖核蛋白溶液與含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振蕩，除去蛋白質(zhì)�；蛘咴诮M織細胞破碎后以低濃度0.14mol/L氯化鈉溶液（也可用0.1mol/L氯化鈉加0.05mol/L檸檬酸代替)反復(fù)洗滌除去核糖核蛋白，再以1mol/L氯化鈉提取脫氧核糖核蛋白，提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白質(zhì)。兩種方法比較，后一種方法使核酸降解可能少一些。以稀鹽溶液提取DNA時，加入適量去污劑更有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離。
應(yīng)用苯酚法也可以提取DNA而且不用經(jīng)過脫氧核糖核蛋白這一步驟，例如大鼠肝勻漿在6%對氨基水楊酸鹽溶液內(nèi)，加入同體積90%苯酚水溶液，室溫下提取1h，再經(jīng)進一步提純可獲得98%～99%純度的DNA。苯酚法也是目前提取DNA最常用的方法之一。
3．活性多肽及遞質(zhì)的提取大體上與蛋白質(zhì)的提取方法相似，可參照進行。經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)如去甲腎上腺素、腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺等均可化學(xué)合成，無需用很多精力去提取。
