免疫球蛋白抗體的提取與純化

　　精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用綜合技術(shù)，避免蛋白變性。如分離IgG時(shí)，多結(jié)合使用鹽析法與離子交換法，以求純化。提取IgM的方法也很多，如應(yīng)用凝膠過濾與制備電泳法，或離子交換與凝膠過濾等。

　　一、鹽析法

　　取x ml血清加x ml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2x ml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。

　　↓4℃，3h以上，使其充分沉淀　　

　　離心（3000rpm),20min,充上清，以x ml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。

　　↓置4℃3h以上，[此時(shí)，（NH4)2SO4的飽和度為33%]

　　重復(fù)上述第二步過程1～2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白，以0.02% mol/L pH7.4PBS溶解至x ml裝入透析袋。

　　↓對(duì)PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測(cè)透析外液無黃色，即無NH4+為止。

　　取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，以751型紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量。

　　影響鹽析的因素很多，如蛋白質(zhì)的濃度，鹽的濃度，飽和度和pH，溫度等都可影響鹽析的結(jié)果，操作時(shí)要充分注意（參閱本章 第二節(jié) )。

　　二、冷酒精沉淀法

　　分離過程如下。血清加3倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié) pH至7.7(±)冷卻到0℃。在激烈攪拌的條件下，加預(yù)冷的酒精（-20℃)到最終濃度為20%，保持在-5℃。產(chǎn)生的沉淀（A)，含有大多數(shù)種類的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷)中，加有0.05mol/L醋酸調(diào)節(jié) pH到5.1，產(chǎn)生的沉淀（B)，包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液內(nèi)。調(diào)節(jié) 上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃)到最終濃度為25%，維持在-5℃。所得到的沉淀（C)含有90%～98% IgG。不同動(dòng)物，IgG分離的條件和產(chǎn)量略有不同。見表2-5。從沉淀（B)可按下述方法進(jìn)一步分離出IgA和IgM的混合物：將沉淀（B)懸浮在0℃ 水中，調(diào)節(jié) pH到5.1，離心去除不溶的蛋白。調(diào)節(jié) 上清液離子強(qiáng)度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最終濃度為10%，保持在 –2℃或-3℃低溫，所得的沉淀（B-B)主要含IgA和IgM。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

表2-5 從幾種動(dòng)物和人血清沉淀A分離IgM的條件

　　三、DEAE-Sephadex A-50 柱層析純化免疫球蛋白

　　原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50)為弱堿性陽(yáng)離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點(diǎn)為pH6.85～7.5)，其余均屬酸性蛋白。PH7.2～7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析，γ球蛋白便可在洗脫中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的IgG.

　　（一)操作步驟

　　1．DEAE-Sephadex A-50預(yù)處理 　稱DEAE-Sephadex A-50（下稱A-50)5g，懸于500ml蒸餾水內(nèi)，1h后傾去上層細(xì)粒。按每克A-50加0.5mol/L NaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液中，攪勻，靜置30min，裝入布氏漏斗（墊有2層濾紙)中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至 pH呈中性；再以0.5mol/L HCl同上操作過程處理，最后以0.5mol/L NaOH 再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1mol/L pH7.4PB中過夜 。

　　2．裝柱

　�。�1)將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。

　�。�2)將0.1mol/L ,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。等A-50。等A-50凝膠沉降2～3cm高時(shí)，開啟出水口螺旋夾，控制流速1ml/min，同時(shí)連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。

　�。�3)關(guān)閉出水口，待A-50凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。

　　3．平衡

　　啟開出水口螺旋夾，控制流速12～14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計(jì)與電導(dǎo)儀分別測(cè)定洗脫液及流出液之pH值與離子強(qiáng)度，兩者達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口，停止平衡。

　　4．加樣及洗脫   啟開上口橡皮塞入下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品（體積應(yīng)<床體積2%，蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)， 至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2～3次 ；再放開出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個(gè)洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12～14滴/min。

　　5．收集

　　開始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集。每管收集3～5ml 。共收集10～15管。

　　6．測(cè)蛋白

　　以751型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管OD 280nm, 與OD 260nm,按公式計(jì)算各管蛋白含量 。并以O(shè)D 280nm為縱座標(biāo)，以試管編號(hào)為橫座標(biāo)，繪制洗脫曲線。

　　7．合并、濃縮

　　將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以PEG（MW6000)濃縮至所需體積，加入0.02% NaN3防腐，于4℃保存?zhèn)溆�。長(zhǎng)期保存時(shí)應(yīng)貯于-40℃冰箱。

　　8．A-50凝膠的再生

　　在柱上先以2mol/L NaCl洗脫蛋白至流出液的OD 280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將A-50再處理一遍即達(dá)到再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中4℃保存；近期不用時(shí)，以無水酒精洗2次， 再置50℃溫箱烘干，裝瓶?jī)?nèi)保存。

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