近10年來，現(xiàn)代分子生物學技術(shù)越來越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領(lǐng)域，為了解病理狀態(tài)下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認為，人類基因組并非人們想像的那樣穩(wěn)定，諸如基因重排、擴增、缺失，突變和DNA甲基化類型改變等時有發(fā)生，這些改變對于基因表達和調(diào)控，以及疾病過程的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸等方面均具有重要意義。
醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學研究的材料來源。在石蠟切片上進行原位雜交或原位PCR分析的分子生物學方法，是免疫細胞化學技術(shù)的重要延伸。通過對DNA或mRNA分析亦可直接證實或補充免疫細胞化學的發(fā)現(xiàn)。這些對形態(tài)學家較為熟悉的原位分子生物學技術(shù)，本節(jié) 不再贅述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986)成功地從蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學研究的需要，結(jié)束了DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細胞的歷史，而且可以廣泛地應用于大宗病例的回顧性研究，對腫瘤發(fā)生的分子機制的探討，診斷與鑒別診斷研究和患者預后評估等方面均具有重要價值。本節(jié) 重點討論石蠟包埋組織DNA提取的方法學及其潛在的應用前景。
一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法
從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而來。Goelz等（1985)最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)（表18-5)，是用機械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，直接進入含SDS和高濃度蛋白酶K（1mg/ml)的提取緩沖液加溫孵育，然后進行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點雜交，印跡雜交等多種分子生物學實驗。Dubeau等（1986)在上述方法上作了改進。首先通過組織切片用二甲苯脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小片段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，從而提高了DNA質(zhì)量，適于做Southern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990)對上述兩種方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法所取得DNA之點雜交結(jié)果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。
表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步驟
| 1．切除多余石蠟，暴露組織 |
| 2．將組織切碎（最大徑<0.5mm)，稱重； |
| 3．溶于TE9提取液（組織<50mg/5ml,50～500mg/10ml),高速混懸2～3min；于48℃放置24h，其制備見表18-6； |
| 4．再次混懸組織，加入蛋白酶K至終濃度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h； |
| 5．用等體積酚-氯仿溶液抽提3次； |
| 6．2.5倍體積乙醇沉淀DNA |
| 7．-70℃放置2～4h |
| 8．9000×g離心1h |
| 9．沉淀物用70%乙醇洗1次 |
| 10．干燥，TE（pH7.2)溶解。 |
表18-6 TE9 DNA提取液的制備
| 500mmol/L | Tris |
| 20mmol/L | EDTA |
| 10mmoo/L | NaCl |
| 1% | SDS |
| 500μg/ml | 蛋白酶K |
| PH8.0 |
5μm組織切片
↓
常規(guī)脫蠟、水化
↓
第一次溶液A孵育（去上清)
↓
第二次溶液A孵育（留上清)
↓
氯仿-異戊醇抽提
↓
RNA酶和蛋白酶消化
↓
酚抽提
↓
沉淀
↓
（卻除未螺旋化DNA)↓
透析
圖18-6 石蠟包埋組織DNA提取流程（Drbeau等，1986)
溶液A
| 2×SSC |
| 100μg 蛋白酶K/ml |
| 1% SDS |
不同類型的基因分析所要求的DNA質(zhì)量長數(shù)量不同。Southern印跡雜交分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb)，因為雜交前要進行相應的限制性內(nèi)切酶消化和凝膠分離不同片段長度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應（PCR)則可在相對粗制的小片段DNA樣本上進行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多，除上述兩種方法外，還有更簡便的直接水煮法（Sle－bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988)、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989)。這些方法不經(jīng)過酚-氯仿-異戊醇抽提、DNA純化等步驟，直接將組織放在去離子水中煮沸10min或在蛋白酶K緩沖液中消化4h，DNA即可釋放出來。此提取物可直接用作模板，進行PCR擴增，但是，我們發(fā)現(xiàn)直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，擴增率較低，且重復性不好。這可能是由于DNA附著的蛋白質(zhì)去除不凈而影響DNA變性和引物的結(jié)合，亦可能是由于標本中殘留的固定劑等成分對Taq DNA多聚酶的抑制所致。
