臨床生物化學(xué):第三節(jié)　基因類腫瘤標(biāo)志物的進(jìn)展及其臨床應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)的理論和技術(shù)的發(fā)展，癌基因和抑癌基因的檢測已成為腫瘤臨床診斷新一代的標(biāo)志物。

正常細(xì)胞的生長與增殖是由兩大類基因調(diào)控的，一類是正向調(diào)控信號，主要是起促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，并且阻止其發(fā)生終末分化傾向，癌的基因起著這一方面的作用，另一類為負(fù)向調(diào)控信號，主要是使細(xì)胞成熟，促進(jìn)終末分化，最后是細(xì)胞凋亡，抑癌基因則在這方面起作用。正常情況下這兩類信號保持著動態(tài)平衡，十分精確地調(diào)控細(xì)胞增殖和成熟。一旦這兩類信號中有一類信號過強(qiáng)或過弱均會使細(xì)胞生長失控而惡變。

一、癌基因

癌基因或腫瘤基因是指在自然或?qū)嶒灄l件下，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因。在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時發(fā)現(xiàn)，將某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因片段嵌入細(xì)胞基因中，并使這些基因迅速地表達(dá)，結(jié)果是被嵌入的細(xì)胞呈惡性轉(zhuǎn)變，特別是如果將這些逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入正常細(xì)胞染色體DNA的特定部位，就能很快地改變這些連接部位的基因表達(dá)，而使細(xì)胞癌變。從目前的資料分析（表8-9)，引起細(xì)胞惡變功能的基因已達(dá)30余種。

表8-9 常見癌基因類腫瘤標(biāo)志物

（一)ras基因家族及其表達(dá)產(chǎn)物

1980年Langbcheim等通過基因轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)了與Harvery及Kristein小鼠肉瘤病毒相似的細(xì)胞癌基因，即c-Ha-ras（1)基因，定位于第11號染色體的11p15區(qū)；c-Ha-ras（2)基因為偽基因（pseudogene)，定位于X染色體上；c-Ki-ras（1)基因為偽基因，定位于第6號染色體6p11-p12區(qū)。Ras基因編碼產(chǎn)物為p21^ras蛋白，其本質(zhì)為膜相關(guān)的G蛋白，具有GTP酶的活化性，參與信號傳導(dǎo)。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤時，編碼p21^ras蛋白的第12、13及61位氨基酸的核苷酸可以發(fā)生點突變，突變型的p21^ras蛋白不具有GTP酶活化，無法使GTP水解為GOP。另外尚可在腫瘤中發(fā)現(xiàn)p21^ras蛋白表達(dá)過度。

⒈可用于ras基因檢測的方法

⑴PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性，singlestrandcomformatinpolymorphism)、DGGE（變性梯度凝膠電泳，denaturedgradientgelelectrophoresis)、PCR-ASO（等位基因特異性寡核苷酸雜交，allelespecificoligonucleotide)和測序技術(shù)（sequencing)：探測點突變。

⑵免疫組織化學(xué)：用RAP-5單抗。

⑶Southern印跡法及Northern印跡法。

⑷ELISA法及Western印跡法。

⒉ras基因家族與腫瘤的關(guān)系（表8-10)

表8-10 ras基因家族與腫瘤的關(guān)系

（二)myc基因家族及其表達(dá)產(chǎn)物

1997年Duesberg等發(fā)現(xiàn)myc癌基因與禽類MC29病毒具有相似性。Myc基因家族共有6成員：c-myc、N-myc、L-myc、P-myc、R-myc及B-myc。其中c-myc、N-myc及L-myc與一些人類腫瘤相關(guān)。c-myc定位于第8號染色體的8q24區(qū)，其編碼產(chǎn)物為439個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。N-myc定位于第2號染色體的2p23-p24區(qū)，其產(chǎn)物為456個氨基酸殘基蛋白質(zhì)。L-myc定位于第1號染色體的1p32區(qū)，編碼產(chǎn)物為364個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。以上蛋白產(chǎn)物定位于核內(nèi)，為核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠與特殊的DNA順序結(jié)合，當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤時，myc基因家族成員可以發(fā)生染色體基因易位、基因擴(kuò)增以及表達(dá)過度。

⒈可用于myc基因檢測的方法

⑴標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞核型分析：基因易位。

⑵原位雜交：ELISA法。

⑶Southern印跡法及Northern印跡法。

⑷RT-PCR方法。

⒉myc基因家族成員與腫瘤的關(guān)系（表8-11)

表8-11 myc基因家族成員與腫瘤的關(guān)系

（三)表皮生長因子受體

1984年Downward研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體與C-erb-B具有相似順序，首先提出具有致癌潛能。

EGFR基因定位于第7號染色體上，編碼產(chǎn)物為P170的糖蛋白，屬于受體型酪氨酸蛋白激酶，能夠與表皮生長因子及其他配基結(jié)合。當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤時，往往發(fā)現(xiàn)EGFR的過度表達(dá)。

⒈可用于EGFR的檢測方法

⑴競爭配基結(jié)合分析（competitiveligand-bindingassay)。

⑵體內(nèi)顯象：用¹¹¹煙標(biāo)記的針對EGFR的單克隆抗體。

⑶Northern印跡法及Western印跡法。

⒉表皮生長因子受體與腫瘤的關(guān)系（表8-12)EGFR的過度表達(dá)與許多臨床腫瘤

表8-12 表皮生長因子受體與腫瘤關(guān)系

密切相關(guān)，尚有研究表明與一些腫瘤的預(yù)后也有一定相關(guān)。

二、抑癌基因（suppressergene)

機(jī)體中有一類對正常細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)節(jié)作用的基因稱為抑癌基因（表8-13)。當(dāng)這類基因丟失、失活或變異時，往往會促使細(xì)胞失控而呈惡性生長。

表8-13 常見抑癌基因類腫瘤標(biāo)志物

（一)RB基因及其表達(dá)產(chǎn)物

1986年Friend等成功地克隆了RB基因。RB基因定位于第13號染色體的13q14區(qū)，共有27個外顯子，26個內(nèi)含子，DNA長度約200kb。其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物為p110。

RB蛋白磷酸化為其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化的主要形式，細(xì)胞G₁/S其RB蛋白磷酸化受周期依賴性激酶cdk2調(diào)節(jié)。在腫瘤細(xì)胞中突變的RB蛋白失去了同核配體結(jié)合的功能。當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤時，RB基因的主要變化形式有：缺失、突變、甲基化、表達(dá)失活及與病毒和細(xì)胞癌蛋白結(jié)合引起功能性失活。

⒈可用于RB基因檢測的方法

⑴PCR-SSCP、DGGE、PCR-ASO及測序技術(shù)：檢測點突變。

⑵PR-PCR、PCR。

⑶PCR-RFLP限制片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism)。

⒉RB基因與腫瘤的關(guān)系

⑴RB基因突變約見于40％的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。

⑵RB基因還與成骨細(xì)胞肉瘤、軟組織肉瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌及膀胱癌有關(guān)。

⑶近期研究表明RB基因還與卵巢癌有關(guān)。

（二)p53基因及其產(chǎn)物

1981年Crawford等發(fā)現(xiàn)了p53基因，并認(rèn)為其為癌基因。以后Hinds、Finlay等通過研究發(fā)現(xiàn)傳染了myc或ras癌基因的細(xì)胞中，若存在野生型p53基因，則出現(xiàn)生長抑制。因此提出p53基因?qū)儆谝职┗�因�?/p>

P53基因定位于第17號染色體17p13區(qū)，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，編碼393個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)即p53蛋白。p53的功能為轉(zhuǎn)錄因子，生物學(xué)功能為G1期DNA損壞的檢查點。人類腫瘤中P53基因突變主要在高度保守區(qū)內(nèi)，以175、248、249、273、282位點突變率最高，不同種類腫瘤其突變類型不同。另外p53變化形式還有缺失、基因重排與腫瘤病毒癌蛋白結(jié)合而失活。

⒈可用于p53基因檢測的方法：同RB基因檢測方法。

⒉p53基因與腫瘤的關(guān)系（表8-14)

表8-14 p53基因與腫瘤的關(guān)系