（八)斑點(diǎn)ELISA
斑點(diǎn)ELISA（dot-ELISA)是近年新發(fā)展的一種ELISA技術(shù)，選用對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)吸附能力的硝酸纖維素薄膜作固相載體，底物經(jīng)酶促反應(yīng)后形成有色沉淀物使薄膜著色，然后目測(cè)或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來(lái)檢測(cè)抗體，也可用來(lái)檢測(cè)抗原，由于該法檢測(cè)抗原時(shí)操作較其他免疫學(xué)試驗(yàn)簡(jiǎn)便，故目前多用于抗原檢測(cè)。
操作方法將待檢血清作1:1～1:20稀釋，用微量加樣器將1µl血清點(diǎn)滴于硝酸纖維素膜（NC)上，置于70℃經(jīng)1h，將NC浸于1％BSA－PBS中，室溫?fù)u蕩1小時(shí)，洗滌2次，加1：1000稀釋的McAb酶標(biāo)記物，室溫?fù)u蕩2小時(shí)，洗滌3次后，加底物3，3'二氨基聯(lián)苯胺或4氯－1－乙萘酚，15分鐘后，流水終止反應(yīng)，以目視法判斷結(jié)果。凡顯示棕色斑點(diǎn)者為陽(yáng)性，否則為陰性。以產(chǎn)生棕色斑點(diǎn)反應(yīng)的最高稀釋度為抗原滴度。
該法簡(jiǎn)易，快速，適合于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，有廣闊的應(yīng)用前景�，F(xiàn)有的資料初步證明具有診斷病人和考核治療效果，國(guó)內(nèi)已用于血吸蟲病，瘧疾，絲蟲病，棘球蚴病的診斷。國(guó)內(nèi)學(xué)者曾比較斑點(diǎn)ELISA和雙抗體夾心ELISA用于檢測(cè)班氏絲蟲病人循環(huán)抗原。采用相同的單克隆抗體和病人血清進(jìn)行兩種方法對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)的特異性均大于95％，但是它們的敏感性有明顯不同，斑點(diǎn)ELISA能檢測(cè)出血清中0.055ng/ml微絲蚴抗原，而雙抗體夾心ELISA僅能測(cè)出≥10ng/ml抗原；并且前者不需要特殊的設(shè)備，適用于絲蟲病流行區(qū)。另有報(bào)告用單克隆抗體－抗原斑點(diǎn)試驗(yàn)（McAb-AsT)檢測(cè)血清抗原診斷黑熱病，效果較為滿意，方法上進(jìn)一步簡(jiǎn)化，加樣以原濃度血清反應(yīng)，效果最佳。國(guó)外還用于旋毛蟲病、絲蟲病、弓形蟲病以及肺孢子蟲病的血清學(xué)診斷方法。
�。ň�)免疫酶染色試驗(yàn)
免疫酶染色試驗(yàn)（immunoenzymic staining test，IEST)是以含寄生蟲病原的組織切片，印片或培養(yǎng)物涂片用作抗原進(jìn)行過(guò)氧化物酶特異免疫染色后在光鏡下檢示樣本中的特異性抗體。在蠕蟲和原蟲感染中均有多種應(yīng)用。
操作過(guò)程抗原組織作冰凍（5～10µm)或石蠟連續(xù)切片（4～8µm)排列于載玻片，經(jīng)丙酮固定貯存于－20℃?zhèn)溆�。原蟲純培養(yǎng)亦可制成分隔涂片，方法均同熒光染色法抗原制片。試驗(yàn)時(shí)先將抗原片在稀釋的過(guò)氧化氫溶液浸泡15分鐘，除去可能存在于組織中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；抗原片用PBS沖洗后經(jīng)Tris緩沖液（PBS，pH7.6)10倍稀釋的正常兔或羊血清培育10分鐘，迅速以PBS洗滌后加檢測(cè)樣本（單個(gè)或系列稀釋度)，置濕盒室溫（20～25℃)或37℃培育30分鐘；PBS洗滌3次，每次5分鐘，然后加兔或羊抗人過(guò)氧化物酶結(jié)合物（參照ELISA法)，結(jié)合物中可加入所用抗原組織片供體動(dòng)物血清約1／25～1／3體積，用以阻斷可能交叉反應(yīng)，降低背景色度；抗原片以PBS洗滌3次后加聯(lián)苯胺（DAB)底物溶液（飽和聯(lián)苯胺液加等量pH7.6硼酸緩沖液，用前按9:1體積加入0.1％H2O2液)，室溫顯色10～15分鐘后在光鏡下觀察反應(yīng)結(jié)果。
反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)：“－”，組織內(nèi)抗原部位不呈現(xiàn)棕紅色；“＋”，組織內(nèi)抗原部位（如血吸蟲肝卵切片中的蟲卵)呈現(xiàn)棕紅色；“＋＋”，局部呈現(xiàn)清晰的棕紅色；“＋＋＋”，呈現(xiàn)非常清晰的棕紅色。
該法簡(jiǎn)單，節(jié)省抗原；判斷結(jié)果不需要特殊儀器；適合于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。IEST可用作輔助診斷病人，考核療效，血清流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)疫情的方法。目前主要應(yīng)用于血吸蟲病、絲蟲病及囊蟲病診斷，也可用來(lái)診斷華支囊吸蟲病、肺吸蟲病、包蟲病和弓形蟲病。
目前對(duì)該方法改進(jìn)有：①用感染鼠肝組織內(nèi)蟲卵制成7µm厚度冰凍切片（或石蠟切片)作為診斷用固相抗原代替可溶性血吸蟲卵抗原作IEST，具有取材容易和應(yīng)用抗原經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。②將冰凍切片置于載玻片上，可以反復(fù)使用載玻片，較一次性用的PVC薄膜／苯氯乙烯反應(yīng)板價(jià)廉，顯著地降低了檢測(cè)費(fèi)用。③判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)用普通光鏡即可。染色標(biāo)本不必即時(shí)檢查�？杀４婧荛L(zhǎng)時(shí)間，便于復(fù)查。④陽(yáng)性血清作最高滴度，可定量抗體水平，用作考核療效有及防治效果的指標(biāo)。⑤IEST的反應(yīng)基本原理與COPT相似，但前者應(yīng)用切片蟲卵代替了COPT的整個(gè)干卵，前法的反應(yīng)快速（約1.5～2小時(shí))而后法較緩慢（需48～72小時(shí))。為此，IEST彌補(bǔ)了COPT診斷時(shí)，漏檢病人和取得結(jié)果不快速的缺陷。病鼠肝組織內(nèi)蟲卵冰凍切片抗原IEST，目前已在疫區(qū)擴(kuò)大應(yīng)用�，F(xiàn)已研制成試劑盒，批量生產(chǎn)，供應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)需用。
（十)免疫印漬試驗(yàn)
免疫印漬試驗(yàn)（immunoblot或Western blot)是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE)，電泳轉(zhuǎn)印及標(biāo)記免疫試驗(yàn)三項(xiàng)技術(shù)結(jié)合而成的一種新型的免疫探針技術(shù)（immuno-probing technique)，是用于分析蛋白抗原和鑒別生物學(xué)活性抗原組分的有效方法，近年已應(yīng)用于檢測(cè)寄生蟲感染宿主體液內(nèi)針對(duì)某分子量抗原的相應(yīng)循環(huán)抗體成分或譜型。是為一項(xiàng)高敏感和高特異的診斷方法，具有很大發(fā)展?jié)摿�。用于診斷的免疫印漬試驗(yàn)以采用酶標(biāo)記的探針（即二抗及其標(biāo)記結(jié)合物)為安全方便，稱酶免疫轉(zhuǎn)移印漬試驗(yàn)（enzyme immuno-transfer blotting，EITB)。
1．操作程序（以血吸蟲EITB為例)
⑴樣本分離：
1)取日本血吸蟲新鮮成蟲按5～10對(duì)／1.5ml比例加樣本緩沖液，勻漿，置沸水浴2分鐘，離心（10000g，30分鐘)，取上清液備用。
2)上述成蟲抗原樣本進(jìn)行單梳SDS－PAGE電泳分離。左側(cè)梳孔加標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，梳孔右側(cè)樣槽加抗原液，電壓控制在160～180V之間。
⑵電泳轉(zhuǎn)�。�
1)從電泳板中取出已完成電泳的凝膠片浸泡于盛有轉(zhuǎn)印緩沖液（TB)的搪瓷盤 內(nèi)。
2)在TB液內(nèi)組成轉(zhuǎn)印夾心板層：取相應(yīng)大小的硝酸纖維（NC)薄膜，徐徐浸泡在TB液，將凝膠片與薄膜光面緊貼。兩面各放置浸濕濾紙兩層而后海綿墊（厚0.5～1cm)一層，做好方位標(biāo)記，最后夾于二層有孔塑料襯板之間，絕對(duì)避免各層之間留有氣泡。醫(yī)學(xué) 全在.線提供gydjdsj.org.cn
3)將TB倒入轉(zhuǎn)印槽中，然后插入轉(zhuǎn)印板，使凝膠片位于陰極側(cè)，NC薄膜位于陽(yáng)極側(cè)。
4)置轉(zhuǎn)印槽于4℃冰箱內(nèi)，通電轉(zhuǎn)印數(shù)小時(shí)或過(guò)夜，電流控制在250mA上下（約40～50V)。
�、翘结槞z測(cè)：
1)取出轉(zhuǎn)印好的NC薄膜，水平地放入猝滅劑中，室溫?fù)u動(dòng)1小時(shí)以封閉未吸附蛋白質(zhì)的區(qū)域，然后用洗滌緩沖液選2～3次，每次30分鐘以除去亦性劑，使蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)和生物學(xué)特性得以恢復(fù)。
2)平置NC薄膜于浸有Tris-緩沖鹽水（TBS)的濾紙上，用刀片將薄膜按電泳方向分割為寬約0.5cm的直條，用鉛筆做好上端標(biāo)記。
3)取其中一個(gè)細(xì)條，并同標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶一起作氨基黑染色（也可用考馬斯亮藍(lán)染或銀染)測(cè)試分離效果并確定分子量位置。其余細(xì)條晾干后置4℃作印漬試驗(yàn)備用（抗原活性可保持3個(gè)月以上)。
�、扔n試驗(yàn)：
1)置上述抗原條于分格反應(yīng)板的反應(yīng)槽內(nèi)，正面向上，每槽一條，預(yù)先用0.05%TBS-Tween液浸濕（TBS-T)；
2)被檢血清用TBS-T液稀釋（常用1:150)，加入反應(yīng)槽中，以浸沒(méi)膜條為限。通常需0.5～1.5ml，相當(dāng)于10µl血樣量（每槽加液量下同)；
3)室溫（20～25℃)振蕩60分鐘，以后用TBS-T洗6次，每次3分鐘；
4)加已稀釋的羊抗人酶結(jié)合物，溫育1.5小時(shí)，洗滌如上；
5)加入新鮮配制的底物溶液（TBS50ml+0.3%萘酚甲醇液3ml+30%H2O210µl；或二氨基聯(lián)苯胺，DAB，5mg/ml 0.05mol/L檸檬酸磷酸緩沖液，pH5.0，每60ml加3%H2O220ul和1%COCl20.2ul 和1%COC120.6ml)；
6)15分鐘后用蒸餾水沖洗數(shù)次以終止反應(yīng)，薄膜條取出置玻板自然干燥；
7)陽(yáng)性反應(yīng)可見藍(lán)黑色（4氯1萘酚底物)或棕褐色（DAB)條帶。
2.主要試劑
⑴樣本緩沖液：含甘油10ml，2-巰基乙醇5ml，10%SDS30ml。
⑵轉(zhuǎn)印緩沖液（TB)：Tris 3g，甘氨酸14g，甲醇250ml，水加至1000ml。
⑶Tris緩沖鹽水（TBS)：10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1調(diào)pH至7.4。
⑷TBS-T液：TBS液內(nèi)含0.05%Tween-20于TBS液。
⑸猝滅劑：1%～5%BSA或0.1%～0.3%Tween-20于TBS液。
⑹氨基黑染液：0.1%W/V氨基黑（C. I. 20470)，45%V/V甲醇，10%V/V冰醋酸。
脫色液：90%V/V甲醇，2%冰醋酸。
EITB用作鑒定寄生蟲抗原的特定組分蛋白及診斷寄生蟲病的方法。在國(guó)外已成功地用于艾滋病的常規(guī)診斷，并且在瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、肺吸蟲、包蟲等的研究分析方面有很多報(bào)道。國(guó)內(nèi)用于檢測(cè)包蟲病患者血清抗體也獲良好結(jié)果，初步應(yīng)用于血吸蟲感染現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，用上述抗原及操作程序可檢示特異的抗腸相關(guān)31/32kD診斷蛋白抗體的條帶，呈現(xiàn)特異和敏感的特性。用本法對(duì)感染宿主不同病期抗體譜型的研究，可望獲得有效化療后早期隱退的特異條帶。批量制備抗原分離的薄膜條帶，有可能成為適用于現(xiàn)場(chǎng)查病的特異性診斷藥盒，不鐵為一項(xiàng)具有診斷潛能的新技術(shù)。
（十一)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體
經(jīng)十多年的研究，單克隆抗體（McAb)廣泛用于寄生蟲病臨床與實(shí)驗(yàn)研究。如寄生蟲蟲種與蟲株的分型和鑒定；建立以檢測(cè)循環(huán)抗原為主的免疫診斷方法；分析和純化抗原制備靶抗原；以及寄生蟲感染免疫，保護(hù)性免疫和蟲苗制備等方面，目前，國(guó)內(nèi)外有報(bào)告，McAb用于瘧疾、弓形蟲病、血吸蟲病、肺吸蟲病、棘球蚴病、絲蟲病等方面。有關(guān)McAb在瘧疾中的應(yīng)用，如對(duì)蟲種，蟲株的鑒定與分型，通過(guò)采用McAb對(duì)環(huán)孢蛋白（circumsporozoite protein，CSP)抗原及裂殖體糖蛋白研究，為瘧原蟲分型鑒定提供了新的依據(jù)；單克隆抗體的應(yīng)用又為提高臨床免疫診斷價(jià)值提供了極好的工具，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已有報(bào)告采用McAb雙夾心斑點(diǎn)金銀染色法和雙夾心斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以檢測(cè)瘧原蟲循環(huán)抗原，陽(yáng)性率分別達(dá)90%～93.3%和85%～86.7%，具有較高的特異性和重復(fù)性，另外發(fā)現(xiàn)某些抗子孢子、裂殖體（子)和配子體的單克隆抗體具有保護(hù)作用。保護(hù)性McAb的發(fā)現(xiàn)不僅為制備蟲苗的靶抗原提供了條件，而且為進(jìn)行被動(dòng)免疫開辟了途徑。
在血吸蟲病方面，單克隆抗體已應(yīng)用于血吸蟲抗原分析，免疫學(xué)診斷和保護(hù)性免疫研究，國(guó)內(nèi)外均已報(bào)道采用檢測(cè)血吸蟲循環(huán)抗原，如Sj23，Sm38，Sj70等抗原，其陽(yáng)性率在90%～97%，交叉反應(yīng)低且有良好的療效考核價(jià)值，有關(guān)保護(hù)性免疫研究方面，主要集中在分子量分別為28kD和38kD的抗原，現(xiàn)有資料初步表明以McAb提純的28kD抗原免疫大白鼠后，可獲得70%的保護(hù)率。
在絲蟲病方面，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)已制備出識(shí)別馬來(lái)微絲蚴表面分子量分別為70kD、75kD、110kD等抗原的McAb，某些McAb能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞粘附于微絲蚴表面，引起蟲體死亡。將這些McAb被動(dòng)轉(zhuǎn)移給受體動(dòng)物，在體內(nèi)能降低微絲蚴血癥。
�。ㄊ�)DNA探針技術(shù)
DNA技術(shù)（probe)技術(shù)，又稱核酸分子雜交（molecular hybridization)技術(shù)，最近幾年迅速發(fā)展起來(lái)的一種敏感性高，特異性強(qiáng)，應(yīng)用面廣的研究手段。在寄生蟲病診斷中，探針是病原體的特異核酸序列，可用來(lái)檢測(cè)出病原體是否存在，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于獲得特異的核酸探針。近10年來(lái)應(yīng)用特異的核酸探針鑒定寄生蟲和診斷寄生蟲病的研究報(bào)道較多，現(xiàn)有資料表明，DNA探針檢測(cè)，其特異性和敏感性高；并且DNA探針是直接檢測(cè)寄生蟲的基因，故比血清學(xué)方法可靠；又因探針DNA較穩(wěn)定，在合適條件下可較長(zhǎng)期保存；在試驗(yàn)條件不變時(shí)試驗(yàn)結(jié)果的重演性較好。在寄生蟲病的診斷、現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、寄生蟲種的鑒定及分類等方面的研究中均已使用了DNA探針技術(shù)，內(nèi)容包括原蟲、吸蟲、線蟲、絳蟲、昆蟲的鑒定和致病的診斷。另外，核酸探針已成功地用于許多傳播媒介體內(nèi)寄生蟲的鑒定。但是一般尚在實(shí)驗(yàn)階段。可望能用作高效和準(zhǔn)確的寄生蟲病血清學(xué)方法，用以制備經(jīng)濟(jì)和理想的診斷抗原。
�。ㄊ�)PCR技術(shù)
檢測(cè)病原體遺傳物質(zhì)用以診斷寄生蟲病的方法，除分子雜交技術(shù)外，新近發(fā)展的更靈敏、快速，并且不需要同位素標(biāo)記的基因擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)是一種體外擴(kuò)增特異性DNA技術(shù)。
現(xiàn)已使用PCR技術(shù)于寄生蟲病診斷，如錐蟲病、利什曼病、肺孢子蟲病、腸球蟲病、賈第蟲病、弓形蟲病等，在一些疾病中，有時(shí)原蟲數(shù)量極少，用一般方法無(wú)法檢測(cè)，經(jīng)用PCR擴(kuò)增DNA模板，提供了一條解決診斷的途徑。如在檢測(cè)錐蟲時(shí)，PCR擴(kuò)增純化DNA可使探針檢測(cè)到血樣中1個(gè)蟲體；國(guó)內(nèi)建立了弓形蟲病PCR診斷方法，具有高度特異、敏感且快速的優(yōu)點(diǎn)。今后在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域中將會(huì)更廣泛深入地開展PCR技術(shù)的應(yīng)用。
