二、免疫論斷及新技術(shù)應(yīng)用
�。ㄒ�)皮內(nèi)試驗(yàn)
利用宿主的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，將特異抗原液注入皮內(nèi)，觀測皮丘及紅暈反應(yīng)以判斷有無特異抗體（IgE)的存在稱皮內(nèi)試驗(yàn)（intradermal test，IDT)。
皮內(nèi)試驗(yàn)用于多種寄生蟲病的檢測，如血吸蟲病、肺吸蟲病等。最常用于血吸蟲病的調(diào)查，操作簡單，并且可即時(shí)觀察結(jié)果，適宜現(xiàn)場應(yīng)用。大多用粗制可溶性血吸蟲蟲卵抗原（稀釋度為1：4000)或成蟲冷浸抗原（稀釋度為1：8000)敏感性高，其陽性率在93％～97％，但有部分假陽性反應(yīng)（2.1％～3.5％)，并且對其他寄生蟲病交叉反應(yīng)較高。皮內(nèi)試驗(yàn)可用作①過篩方法，先作皮試，陽性者再作進(jìn)一步追查；②臨床輔助診斷；③考核預(yù)防效果，用作檢查新感染的方法，特別對兒童。
�。ǘ�)染色試驗(yàn)
染色試驗(yàn)（dye test，DT)是比較獨(dú)特的免疫反應(yīng)，是目前診斷弓形蟲病較好的方法，已廣泛用于該病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
新鮮弓形蟲滋養(yǎng)體和正常血清混合，在37℃作用1小時(shí)或室溫?cái)?shù)小時(shí)后，大部分弓形蟲失去原來的新月形，而變?yōu)閳A形或橢圓形，用堿性美藍(lán)染色時(shí)著色很深。但新鮮弓形蟲和免疫血清混合時(shí)，蟲體仍保持原有形態(tài)，用堿性美藍(lán)染色時(shí)，著色很淺或不著色。其原因可能是由于弓形蟲受到特異體抗體和輔助因子協(xié)同作用后，蟲體細(xì)胞變性，結(jié)果蟲體對堿性美藍(lán)不易著色。
材料和試劑以弓形蟲速殖子為抗原；采用正常人血清為致活因子。堿性美藍(lán)溶液，取美藍(lán)10g加入95％酒精100ml，制成飽和酒精溶液，過濾后取3ml加pH11，要求臨用時(shí)新鮮配制。待檢血清經(jīng)56℃30分鐘滅活，冰箱保存?zhèn)溆谩?/P>
方法將待檢血清用生理鹽水倍比稀釋，每孔0.1ml，加上述稀釋的弓形蟲速殖子0.1ml，置37℃水浴1小時(shí)，加堿性美藍(lán)溶液0.02ml／孔，37℃水浴15分鐘，以每孔聚懸液1滴于載玻片上，加蓋玻片，高倍顯微鏡檢查，計(jì)數(shù)100個(gè)弓形蟲速殖子，統(tǒng)計(jì)著色和不著色速殖子比例數(shù)。
結(jié)果判定以能使50％弓形蟲不著色的血清最高稀釋度為該血清染色試驗(yàn)陽性效價(jià)。陽性血清稀釋度1：8為隱性感染；1：256為活動性感染；1：1024為急性感染。
�。ㄈ�)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)
環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（circumoval precipitin test，COPT)是以血吸蟲整卵為抗原的特異免疫血清學(xué)試驗(yàn)，卵內(nèi)毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲卵周圍形成特殊的復(fù)合物沉淀，在光鏡下判讀反應(yīng)強(qiáng)度并計(jì)數(shù)反應(yīng)卵的百分率稱環(huán)沉率。
1．常規(guī)法用載玻片或凹玻片進(jìn)行，加樣本血清后，挑取適量鮮卵或干卵（約100～150個(gè)，從感染動物肝分離)，覆蓋24×24mm蓋片，四周用石蠟密封，37℃保溫48小時(shí)后，低倍鏡觀察結(jié)果，必要時(shí)需觀察72小時(shí)的反應(yīng)結(jié)果。典型的陽性反應(yīng)為泡狀、指狀、片狀或細(xì)長卷曲狀的折光性沉淀物，邊緣整齊，與卵殼牢固粘連。陰性反應(yīng)必須觀察全片；陽性者觀察100個(gè)成熟卵，計(jì)環(huán)沉率及反應(yīng)強(qiáng)度比例。環(huán)沉率是指100個(gè)成熟蟲卵中出現(xiàn)沉淀物的蟲卵數(shù)。凡環(huán)沉率≥5％者可報(bào)告為陽性，（在基本消滅和消滅血吸蟲病地區(qū)環(huán)沉率≥3％者可判為陽性)，1％～4％者為弱陽性。環(huán)沉率在治療上具有參考意義。
2．分級強(qiáng)度判定
“－”折光淡，與蟲卵似連非連；“影狀”物（外形不甚規(guī)則，低倍鏡下有折光，高倍鏡下為顆粒狀)及出現(xiàn)直徑小于10μm的泡狀沉淀物者，皆為陰性。
“＋”蟲卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物（＞10μm)，累計(jì)面積小于蟲卵面積的1／2；或呈指狀的細(xì)長卷曲樣沉淀物，不超過蟲卵的長徑。
“＋＋”蟲卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物的面積大于蟲卵面積的1／2；或細(xì)長卷曲樣沉淀相當(dāng)或超過蟲卵的長徑。
“＋＋＋”蟲卵外周出現(xiàn)泡狀沉淀物的面積大于蟲卵本身面積；或細(xì)長卷曲樣沉淀物相當(dāng)或超過蟲卵長徑的2倍。
3．近年來對COPT的方法作了一些改進(jìn)如①雙面膠紙條法：將雙面膠紙條制特定的式樣作COPT，可省略蠟封片法的繁瑣步驟，具有操作簡易，方法規(guī)范，提高工效和避免空氣污染的優(yōu)點(diǎn)。雙面膠紙條法COPT（DGS－COPT)已在現(xiàn)場擴(kuò)大應(yīng)用，今后若能將該法配套干卵，則更能提高它的應(yīng)用價(jià)值；②血吸蟲干卵抗原片（或膜片)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)，利用環(huán)卵抗原活性物質(zhì)的耐熱特性，將分離的純卵超聲和熱處理，定量滴加，烤干固定于載玻片或預(yù)制的聚乙稀薄膜上。此種干卵膜片，保存時(shí)間較長（4℃半年)，已有市售商品。試驗(yàn)時(shí)只需加入血清試樣，濕盒孵育，判讀結(jié)果與常規(guī)法相同。干卵膜片法還具有簡化操作規(guī)程，提高卵抗原的規(guī)范要求，并可長期保存等優(yōu)點(diǎn)。
COPT可作為診斷血吸蟲病的血清學(xué)方法之一，及臨床治療病人的依據(jù)；可用作考核治療和防治效果的方法；并且用于血清流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測疫情的方法。
�。ㄋ�)間接血凝試驗(yàn)
間接血凝試驗(yàn)（indirect haemagglutination test，IHA)是以紅細(xì)胞作免疫配體的載體，并以紅細(xì)胞凝集讀數(shù)的血清學(xué)方法。最常用的紅細(xì)胞為綿羊或人（O型)紅細(xì)胞，來源方便。目前均用醛化紅細(xì)胞，可保存半年而不失其免疫吸附性能。
操作步驟如下：
1．紅細(xì)胞鞣化和致敏�、偃∪┗t細(xì)胞用0.15mol／L，pH7.2PBS離心洗滌2次，并用PBS配成2.5％懸液；②加等量1:2000鞣酸溶液（鞣酸不同批號，質(zhì)量相差較大必須預(yù)試測定適宜濃度)37℃孵育20分鐘，經(jīng)常搖動；③離心去上清，PBS洗1次，再用0.15mol／L，pH6.4PBS配成10％懸液；④每份懸液加等量適當(dāng)稀釋的抗原液，置于37℃水浴箱中30分鐘（每5分鐘振動一次)，離心去上清，pH7.2PBS洗2次，再用含1％正常兔血清（NRS)10％蔗糖緩沖液配成5％細(xì)胞懸液。加1‰疊氮鈉防腐，存4℃或減壓凍干備用，每批致敏細(xì)胞均需用已知陽性和陰性血清滴定靈敏度或特異性。陽性滴度在1:640以上，陰性血清不出現(xiàn)反應(yīng)者可用。
2．微量血凝試驗(yàn) 在U型（或V型)微量血凝板上，將被試血清用1％NRS或BSA生理鹽水作倍比系列稀釋，每孔含稀釋血清0.05ml。每孔加0.01ml致敏紅細(xì)胞懸液（可用標(biāo)定過的OT針頭滴加)，充分振蕩搖勻，加蓋于室溫靜置1～2小時(shí)讀取結(jié)果。
3．根據(jù)紅細(xì)胞在孔底的沉積類型而定�！埃�，紅細(xì)胞沉于管底，呈圓點(diǎn)形，外周光滑；“±”，紅細(xì)胞沉于管底，周圍不光滑或中心有白色小點(diǎn)；“＋”，紅細(xì)胞沉積范圍很小，呈較明顯的環(huán)形圈；“＋＋”，紅細(xì)胞沉積范圍較小，其中可出現(xiàn)淡淡的環(huán)形圈；“＋＋＋”，紅細(xì)胞布滿管底呈毛玻璃狀；“＋＋＋＋”，紅細(xì)胞呈片狀凝集或邊緣卷曲。呈明顯陽性反應(yīng)（＋)的最高稀釋度為該血清的滴度或效價(jià)。
目前對血吸蟲病應(yīng)用純化蟲卵抗原間接血凝試驗(yàn)。采用經(jīng)SephadexG－100柱層析純化的血吸蟲卵抗原致敏紅細(xì)胞作IHA，提高了方法的敏感性，特異性和重現(xiàn)性，為在疫區(qū)擴(kuò)大應(yīng)用提供了條件。
IHA操作簡便，敏感性高，適于現(xiàn)場使用，可作為輔助論斷病人，流行病學(xué)調(diào)查及綜合查病方法。先后在多種寄生蟲感染中應(yīng)用，如血吸蟲，瘧疾、豬囊蟲，旋毛蟲，肺吸蟲，阿米巴，弓形蟲，肝吸蟲等。有些已制成商品診斷藥盒。不足之處是不能提供檢測抗體的亞型類別，和容易發(fā)生異常的非特異凝集。另外抗原的標(biāo)準(zhǔn)化，操作方法規(guī)范化急待解決，以提高其診斷效果和可比性。
