細(xì)胞和分子免疫學(xué):第三節(jié)　抗獨(dú)特型抗體及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

針對(duì)外來抗原的抗體分子（Ab1)可變區(qū)上Id可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗Id抗體（Ab2)。Ab2β具有與外來抗原相似的氨基酸排列順序或空間構(gòu)型，它能夠在體內(nèi)模擬始動(dòng)抗原的作用。應(yīng)用Ab2β的這一特性，可有目的地制備Ab2β，將其作為抗原的替代物用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究。

一、抗獨(dú)特抗體的制備

（一)抗原及其用量的選擇

由于Ab2是針對(duì)Ab2Id的抗體，因而制備Ab2時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)腁b1作為免疫原。所用抗原的用量依照給予抗原的種類、次數(shù)、途徑以受體動(dòng)物的耐受性而有所不同。一般來說，當(dāng)受體動(dòng)物為小鼠時(shí)，常用Ab1最為50-200μg；若受體動(dòng)物為家兔時(shí)，使用的Ab1量可達(dá)100-200μg。

（二)免疫動(dòng)物的選擇

抗獨(dú)特型抗體可在自身體內(nèi)、同類系、同種異體以及異種動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此在制備抗獨(dú)特型抗體時(shí)可根據(jù)不同情況選用同類系、同種異體或異種動(dòng)物（表9-1)。從制備技術(shù)上講，可以制備單克隆抗Id和多克�。�免疫血清)抗Id。

表9-1 不同宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗體決定簇及抗獨(dú)特型抗體的制備

1.同類系動(dòng)物　用某一種抗原免疫某一品系的動(dòng)物，分離純化的Ab1再免疫相同品系的另外一只動(dòng)物，可獲得抗獨(dú)特型體。例如Uytdegaag等將Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)制備了單克隆抗體（Ab1),再用Ab1免疫BALB/c小鼠，制備了單克隆Ab2。

2.同種異型動(dòng)物　Seto等從一只品系為a3b4家兔血清中純化出IgG作為Ab1，然后免疫B/J品系家兔，得到了含有Ab2的免疫血清。用此方法制備的抗血清中，除了含有抗Id外，還含有抗同種異型決定簇的抗體。

3.異種動(dòng)物　例如用人IgM作為Ab1免疫小鼠制備單克隆Ab2。由異種動(dòng)物免疫制備的Ab2血清中，除抗Id外還含有抗同種型的抗體。

（三)抗獨(dú)特型抗體的檢測

抗Id抗體的鑒定至關(guān)重要。通常采用免疫學(xué)檢測方法如ELISA、RIA、免疫熒光和中和試驗(yàn)等，可根據(jù)具體條件和需要加以選用�？笽d的鑒定必須設(shè)置充分的對(duì)照，確保檢測結(jié)果的可靠性。例如，在鑒定小鼠源性抗原特異性人IgM抗獨(dú)特型抗體時(shí)，用正常人IgM作為對(duì)照。將Ab1（抗原特異性人IgM)包被微孔板，然后加檢測樣品（小鼠源性抗Id)，再加抗鼠的標(biāo)記抗體，為了克服非特異性鼠抗人IgM同種型Ig造成的假陽性，同時(shí)用非特異性人IgM包被微板作為對(duì)照（圖9-9)。當(dāng)試驗(yàn)孔為陽性、對(duì)照孔為陰性時(shí)可基本確定為抗Id抗體。

圖9-9 用ELISA間接法檢測鼠源性單克隆抗Id示意圖

二、抗獨(dú)特型抗體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

抗獨(dú)特型抗體不僅對(duì)于免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的理論研究具有重要意義，而且在傳染性疾病的預(yù)gydjdsj.org.cn/pharm/防、自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)理研究和惡性腫瘤的治療等應(yīng)用研究中也具有重要的價(jià)值。

（一)抗獨(dú)特型抗體與疫苗

抗獨(dú)特型抗體中Ab2β作為抗原的模擬物，可代替病原體的抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病原體的特異性免疫應(yīng)答，即所謂抗獨(dú)特型疫苗（anti-idiotype vaccine)。目前，抗獨(dú)特型疫苗研究仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段，疫苗的范圍主要有病毒、細(xì)菌和原蟲等引起的傳染�。ū�9-2)。

1.抗病毒的抗獨(dú)特型疫苗　針對(duì)病毒感染的抗獨(dú)特型疫苗是近年來較活躍的研究領(lǐng)域。Reagan將狂犬病毒糖蛋白特異的單克隆抗體免疫動(dòng)物，制備出抗Id抗體，將這些抗體注射小鼠后，可誘導(dǎo)出具有病毒特異性中和活性的抗體應(yīng)答。Kennedy等用抗HBsAg抗體制備出抗獨(dú)特型抗體，經(jīng)親和層析純化后注射于BALB/c小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)HBsAg的體液免疫應(yīng)答。

Uytdehaag等用對(duì)Ⅱ型脊隨灰質(zhì)炎病毒特異的保護(hù)性單克隆抗體（Ab1)免疫BALB/c小鼠,制備出單克隆Ab2，用Ab2免疫BALB/c小鼠后，可誘導(dǎo)出Ab3，產(chǎn)生抗脊髓灰質(zhì)炎病毒的保護(hù)性免疫，這種單克隆Ab2可用于預(yù)防Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染。Tanaka等在BALB/c小鼠中用抗新城疫病毒（NDV)血凝素的抗體誘導(dǎo)出抗Id抗體，在無病毒抗原存在的情況下，這種抗Id抗體可刺激小鼠產(chǎn)生抗NDV抗體。Lathey用單純皰疹病毒（HSV)糖蛋白D特異的McAb制備了抗Id抗體，并在小鼠中誘發(fā)對(duì)HSV的免疫應(yīng)答。用人工合成HIV包膜抗耕牛的735-752氨基酸段的多肽免疫黑猩猩制得Ab1，再用Ab1免疫家兔制備Ab2，將Ab2免疫小鼠獲得Ab3，實(shí)驗(yàn)表明，Ab3能與HIV多肽抗原發(fā)生特異性結(jié)合。

圖9-10 HBsAg抗Id的實(shí)驗(yàn)研究（Kennedy,1984)

2.抗細(xì)胞菌和原蟲的抗獨(dú)特型疫苗　抗Id抗體也可用于誘導(dǎo)針對(duì)細(xì)菌和原蟲的保護(hù)性免疫應(yīng)答。例如，用Ab2誘導(dǎo)動(dòng)物針對(duì)肺炎球菌、大腸桿菌（K13)、血吸蟲和羅德西亞錐蟲等病原體的保護(hù)性免疫。其Ab2的制備和研究方法與病毒性抗Id疫苗研究類似。

抗Id作為疫苗有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)不含有傳染性物質(zhì)；（2)可大量制備抗Id的McAb；（3)某些保護(hù)性抗原決定簇為碳水化合物，不能用DNA重組技術(shù)獲得，而某些抗Id可模擬碳水化合物抗原決定簇；（4)能誘導(dǎo)比滅活病毒更為有效的T細(xì)胞應(yīng)答；（5)誘導(dǎo)抗原決定簇特異性的抗Id疫苗。應(yīng)該看到，抗Id疫苗的免疫應(yīng)答水平一般較低，大劑量鼠源性免疫球蛋白可能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗異種蛋白的免疫反應(yīng)以及過敏反應(yīng)。因此，在臨床實(shí)際應(yīng)用中，制備人源性抗Id疫苗，應(yīng)該看到，抗Id疫苗的免疫應(yīng)答水平一般較低，大劑量鼠源性免疫球蛋白可能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗異種蛋白的免疫反應(yīng)以及過敏反應(yīng)。因此，在臨床實(shí)際應(yīng)用中，制備人源性抗Id疫苗，提高抗Id疫苗的免疫原性，以及細(xì)胞工程和基因工程相結(jié)合等方面有待進(jìn)一步深入研究。

（二)抗獨(dú)特型抗體與自身免疫性疾病

自身免疫病是機(jī)體產(chǎn)生對(duì)自身成份的免疫應(yīng)答并造成病理損害而引起的一系列疾病，常與自身隱蔽抗原的釋放、自身反應(yīng)的T細(xì)胞克隆激活以及由于具有與自身交叉反應(yīng)抗原的病原體感染有關(guān)。隨著免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說和抗獨(dú)特型抗體研究的發(fā)展，進(jìn)一步提示了抗獨(dú)特型抗體與某些自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。

表9-2 抗獨(dú)特型疫苗的研究

1.抗獨(dú)特型抗體與重癥肌無力　1971年，Bartels等合成了稱之為Bis-Q(trans-3,3`-bis[(α-trimethylammonio methyl)azobenzene]的化合物，發(fā)現(xiàn)Bis-Q可模擬乙酰膽鹼（acetylcholine,Ach)與乙酰膽鹼受體（acetylcholinereceptor,AchR)結(jié)合。繼而，Erlanger將Bis-Q與蛋白載體交聯(lián)，制備了Bis-Q特異性抗體。1982年Wassermann等用抗Bis-Q抗體免疫家兔，由于抗Bis-Q能模擬AchR，免疫后產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體可模擬抗AchR，結(jié)果在接受抗Bis-Q免疫的5只家兔中，在第1次加強(qiáng)免疫后就有4只產(chǎn)生了實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力（myasthenia gravis,MG)的癥狀，但第2次加強(qiáng)免疫后MG癥狀又有所減輕。他們認(rèn)為，第1次免疫后產(chǎn)生了抗AchR，阻斷了運(yùn)動(dòng)終板處Ach與AchR的結(jié)合，與MG的癥狀產(chǎn)生有關(guān)。而第2次免疫后，由于注入的抗Bis-Q對(duì)血清中抗AchR抗體有中和作用，抑制了抗AchR的作用，使MG癥狀緩解。重癥肌無力患者血清中，除了發(fā)現(xiàn)有抗AchR的自身抗體外，還可能存在針對(duì)Ach抗體的抗Id抗體，Ach可刺激抗Ach抗體的產(chǎn)生，Ab1可變區(qū)的Id又可刺激抗Id抗體產(chǎn)生，Ab2作為Ach的模擬和換封閉了神經(jīng)肌肉接頭的AchR，從而導(dǎo)致神經(jīng)-肌肉接頭功能障礙，發(fā)生MG癥狀。

圖9-11 Bis-Q、αBisQ和ααBis-Q與實(shí)驗(yàn)性MG發(fā)生的關(guān)系

1984年，Erlanger等又進(jìn)一步以α-Bis-Q為抗原免疫小鼠，制備了分泌ααBis-QId McAb的雜交瘤細(xì)胞株，將此雜交瘤細(xì)胞注入到小鼠腹腔，小鼠發(fā)生自身免疫性MG，這是由于雜交瘤所分泌的αα-Bis-QId McAb可模擬抗AchR抗體的作用，與Bis-Q的封閉作用相似。

2.抗獨(dú)特型抗體與促甲狀腺受體病　甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)（簡稱甲亢)的病因尚不十分清楚。以往認(rèn)為，病人血清中存在著抗促甲狀腺素受體（thyroid stimulating lormone receptor,TSHR)的抗體，由于該抗體與TSHR的結(jié)合可模擬TSH的配體作用，因而刺激產(chǎn)生甲狀腺素，導(dǎo)致患都產(chǎn)生甲亢的癥狀，并將抗TSHR稱為長效甲狀腺刺激素（long acting thyroidstimulator,LATS)。以后研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)抗TSH的獨(dú)特型抗體中有一部分應(yīng)能模擬TSH的作用，能與TSHR結(jié)合而刺激甲狀腺素的分泌。

進(jìn)一步研究證實(shí)：（1)來自甲亢患者血清中TSHαId可促進(jìn)甲狀腺上皮細(xì)胞對(duì)碘的攝��；（2)αId作為TSHR的配體，檢測到TSHR的分子量為197kDa；（3)αId的Fab段可直接與TSh McAb結(jié)合并TSH與TSH McAb的結(jié)合，TSH也可抑制αId與TSHR的結(jié)合。

3.抗獨(dú)特型抗體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中存在類風(fēng)濕因子（rheumatoid tacfor,RF),在來自不同個(gè)體的類風(fēng)濕因子之間存在著不同程度的交叉反應(yīng)，表明這些RF存在著交叉反應(yīng)獨(dú)特型（IdX)。Bona等在研究針對(duì)人IgM型RF的IdX時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種特殊的抗獨(dú)特型抗體，稱為epidody，這種抗體不僅能與IgM類風(fēng)濕因子可變區(qū)結(jié)合，同時(shí)也可與IgG的Fc段結(jié)合。Chen等合成了與該種Igm RF可變區(qū)IdX中氨基酸序列相同的一段多肽作為抗原，免疫家兔制備抗體，結(jié)果該抗體可與Igm RF的輕鏈和IgG結(jié)合，提示IgMRF的輕鏈和IgG上具有交叉反應(yīng)性抗原決定簇。以上述實(shí)驗(yàn)為依據(jù)，似乎存在這樣的可能：由RF刺激機(jī)體產(chǎn)生的epibody可廣泛地與人Igg Fc段結(jié)合，所形成的免疫復(fù)合物沉積于關(guān)節(jié)滑膜等部位，導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫損傷。此外，有人認(rèn)為許多自身抗體上具有交叉反應(yīng)Id，這些IdX與外界微生物感染時(shí)誘發(fā)產(chǎn)生抗體的Id有交叉反應(yīng)。當(dāng)相應(yīng)的微生物感染機(jī)體時(shí)，刺激產(chǎn)生特異性抗體以及相應(yīng)的抗Id抗體，后者可通過與自身抗體可變區(qū)上IdX的相互作用，誘發(fā)自身免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致免疫損傷。

(三)抗獨(dú)特型抗體與腫瘤免疫

表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的腫瘤相關(guān)抗原刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的抗體(Ab1),用這種Ab1免疫另一小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)Ab1的抗獨(dú)型抗體,其中Ab2β（模擬腫瘤相關(guān)抗原)注入荷腫瘤的動(dòng)物或病人可誘導(dǎo)出稱之為抗-抗-獨(dú)特型抗體的Ab3，由于這種Ab3與最初腫瘤相關(guān)抗原所誘導(dǎo)的Ab1具有相同的抗原特異性，因此又稱為Ab1`。

圖9-12 模擬腫瘤相關(guān)抗原的Ab2β誘導(dǎo)出Ab3（Ab1`)

采用模擬腫瘤相關(guān)抗原的Ab2β刺激機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，已在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，包括B淋巴細(xì)胞腫瘤、T細(xì)胞性白血病、乳腺癌、黑素瘤、小鼠肉疚、結(jié)腸癌、胰腺癌等（表9-3)。目前，有幾種腫瘤相關(guān)抗原抗Id已開始臨床I期驗(yàn)證，有些病例顯示出一定的療效。

Lery等（1982、1985)應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備了針對(duì)病人結(jié)節(jié)性淋巴瘤B細(xì)胞表面免疫球蛋白的αId（4D6)，獲得一定的療效（圖9-13)。

在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，有的腫瘤相關(guān)抗原如黑素瘤相關(guān)蛋白聚糖（MPG)難于在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出MPG特異性抗體，但是模擬MPG抗原的Ab2β可誘導(dǎo)出腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗原，提示Ab2β可能通過打破機(jī)體對(duì)某些腫瘤相關(guān)抗原的天然免疫耐受，從而誘導(dǎo)相體產(chǎn)生抗腫瘤相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答。

需要注意的是抗Id在一定條件下可抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答。Flood等（1980)報(bào)道了由抗IdT細(xì)胞所誘導(dǎo)的免疫抑制作用。小鼠纖維肉瘤1591和1316都有很強(qiáng)的免疫原性，在正常情況下移植到小鼠體內(nèi)后100%被排斥。如先用纖維肉瘤1591效應(yīng)T淋巴母細(xì)胞（含TCr Id)免疫正常同類系小鼠，然后分為兩組，分別移植1591和1316肉瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植1591組約有2/3小鼠喪失排斥肉瘤的能力，而移植1316組仍100%被排斥，說明TCr Id T淋巴母細(xì)胞所誘導(dǎo)的免疫抑制作用是特異性的，其機(jī)理可能是αIdT細(xì)胞殺傷或抑制了肉瘤特異性T效應(yīng)細(xì)胞。

表9-3　腫瘤相關(guān)抗原抗Id臨床前研究和臨床I期驗(yàn)證（舉例)

注：CTLC:cutaneousT cell lymphoma

CEA:carcinoembryonic antigen

MPG:melanoma-associatedproteoglycan

high-MrMAA:human high molecularmass melanoma associated antigen

圖9-13 抗Id（4D6)治B細(xì)胞瘤示意圖

（金伯泉 許輝)