實用免疫細胞與核酸:第四節(jié)　石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用

近10年來，現(xiàn)代分子生物學技術(shù)越來越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領(lǐng)域，為了解病理狀態(tài)下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認為，人類基因組并非人們想象的那樣穩(wěn)定，諸如基因重排、擴增、缺失，突變和DNA甲基化類型改變等時有發(fā)生，這些改變對于基因表達和調(diào)控，以及疾病過程的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸等方面均具有重要意義。

醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學研究的材料來源。在石蠟切片上進行原位雜交或原位PCR分析的分子生物學方法，是免疫細胞化學技術(shù)的重要延伸。通過對DNA或mRNA分析亦可直接證實或補充免疫細胞化學的發(fā)現(xiàn)。這些對形態(tài)學家較為熟悉的原位分子生物學技術(shù)，本節(jié)　不再贅述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986)成功地從蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學研究的需要，結(jié)束了DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細胞的歷史，而且可以廣泛地應(yīng)用于大宗病例的回顧性研究，對腫瘤發(fā)生的分子機制的探討，診斷與鑒別診斷研究和患者預(yù)后評估等方面均具有重要價值。本節(jié)　重點討論石蠟包埋組織DNA提取的方法學及其潛在的應(yīng)用前景。

一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法

從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而來。Goelz等（1985)最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)（表18-5)，是用機械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，直接進入含SDS和高濃度蛋白酶K（1mg/ml)的提取緩沖液加溫孵育，然后進行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點雜交，印跡雜交等多種分子生物學實驗。Dubeau等（1986)在上述方法上作了改進。首先通過組織切片用二甲苯脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小片段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，從而提高了DNA質(zhì)量，適于做Southern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990)對上述兩種方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法所取得DNA之點雜交結(jié)果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。

表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步驟

表18-6 TE9 DNA提取液的制備

5μm組織切片

↓

常規(guī)脫蠟、水化

↓

第一次溶液A孵育（去上清)

↓

第二次溶液A孵育（留上清)

↓

氯仿-異戊醇抽提

↓

RNA酶和蛋白酶消化

↓

酚抽提

↓

沉淀

↓

（卻除未螺旋化DNA)↓

透析

圖18-6　石蠟包埋組織DNA提取流程（Drbeau等，1986)

溶液A

不同類型的基因分析所要求的DNA質(zhì)量長數(shù)量不同。Southern印跡雜交分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb)，因為雜交前要進行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化和凝膠分離不同片段長度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR)則可在相對粗制的小片段DNA樣本上進行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多，除上述兩種方法外，還有更簡便的直接水煮法（Sle－bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988)、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989)。這些方法不經(jīng)過酚-氯仿-異戊醇抽提、DNA純化等步驟，直接將組織放在去離子水中煮沸10min或在蛋白酶K緩沖液中消化4h，DNA即可釋放出來。此提取物可直接用作模板，進行PCR擴增，但是，我們發(fā)現(xiàn)直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，擴增率較低，且重復(fù)性不好。這可能是由于DNA附著的蛋白質(zhì)去除不凈而影響DNA變性和引物的結(jié)合，亦可能是由于標本中殘留的固定劑等成分對Taq DNA多聚酶的抑制所致。

二、影響DNA提取質(zhì)量的因素

1．固定劑對DNA的影響固定劑的類型直接影響提取DNA的質(zhì)量。目前大多數(shù)實驗室常用的中性緩沖福爾馬林固定的標本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Warford等（1988)對甲醛固定過程中DNA變化進行了觀察，發(fā)現(xiàn)核酸對甲醛反應(yīng)性可分為兩個階段：①早期出現(xiàn)堿基快速可逆性羥甲基化；②數(shù)天后堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)。DNA提取過程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和純化等步驟，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性質(zhì)改變。

bramwell等（1988)發(fā)現(xiàn)，甲醛和戊二醛固定可使得DNA產(chǎn)量降低，醋酸甲醇（MAA)可導(dǎo)致DNA明顯降解。Michel’s運輸保存液或PBS存放組織雖提取DNA純度高，但產(chǎn)量明顯降低。Dubeau等也觀察到含苦味酸（Bouin氏液)和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs)處理標本不能獲得完整的DNA。

乙醇被認為是保存核酸的最佳固定劑。Wu等（1990)用無水乙醇固定標本48h，最長達2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm³乙醇固定標本平均DNA產(chǎn)量為26.6μg,高于新鮮標本（19.4μg/mm³)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，乙醇固定組織DNA均顯示由于重復(fù)DNA序列存在所產(chǎn)生的特征性衛(wèi)星帶，說明DNA被完成消化。Southern印跡雜交結(jié)果與冰凍組織一致。

Sato 等（1990)用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好無損。其基本方法為：將組織放至4℃丙酮浸透，移至-20℃過夜。然而再用丙酮分別在4^℃和室溫脫水各15min，苯甲酸透明兩次，每次15min，最后60℃真空浸蠟2～3h，石蠟包埋。結(jié)果顯示，每10mg AMex法處理的濕重組織提高分子量DNA71.4±14.53μg，與新鮮組織產(chǎn)量相當（70.4±13.76μg)。酶切、電泳和雜交反應(yīng)亦相同于新鮮組織。提示AMex法是一種多用途組織處理技術(shù)，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA減少和內(nèi)切酶不完全消化所產(chǎn)生的電泳類型改變，是一種理想的DNA保存方法，特別適用于對形態(tài)學、免疫表型和基因改變的相關(guān)性分析。

2．固定時間對DNA的影響固定過程中所發(fā)生的組織反應(yīng)至今尚未被完全更理解，雖然理論上講室溫下福爾馬林與DNA幾乎不發(fā)生反應(yīng)，但已發(fā)現(xiàn)堿基與組蛋白之間的甲基交聯(lián)。這種福爾馬林介導(dǎo)的甲基化直接影響DNA提取的效率。如果事實果真如此，那么固定的時間是一個重要的變異因素。然而，Goelz等沒有發(fā)現(xiàn)固定時間對DNA提取質(zhì)量的明顯影響。Dubeau等認為組織固定時間太短或太長均會導(dǎo)致DNA的降解。該作者對固定12h到5天不同時間間隔標本的DNA提取顯示，隨著固定時間的延長，可螺旋化（Spoolable)的高分子量DNA明顯減少。固定5天后可螺旋化DNA提取率僅有8%。Warford等也發(fā)現(xiàn)單細胞懸液經(jīng)30min福爾馬林固定后，DNA產(chǎn)量減少到30%，由此可見，不同標本對不同固定劑所需的最佳固定時間應(yīng)摸索選定。根據(jù)Dubeau等經(jīng)驗，常規(guī)組織固定應(yīng)在12h以上至110之內(nèi)。

3．固定溫度等其他因素對DNA的影響核酸與固定劑的反應(yīng)由反應(yīng)成分、濃度、酸鹼度以及溫度等因素的調(diào)節(jié)　，其中溫度效應(yīng)顯得特別重要。室溫下DNA雙股螺旋鏈表現(xiàn)為兩條由氫鍵連接在互補多聚核苷酸；加熱到65℃時，氫鍵開始斷裂；約90^℃時，產(chǎn)生兩條單鏈分子。在此變性狀態(tài)下，甲醛與酸反應(yīng)很快，通過羥甲基化作用可抑制DNA冷卻后的再復(fù)性。

最近，Koshiba等發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定過程中的DNA降解，是由于固定溫度高，pH低以及甲酸的存在所致。通過應(yīng)用緩沖福爾馬林和低溫下固定（4℃)，可以明顯改善DNA保存。

酸性環(huán)境中DNA的降解已有過深入的研究。一般認為，強酸可導(dǎo)致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些結(jié)構(gòu)的改變。當pH達到2.5以下時，幾乎所有的堿基之間氫鍵解離，使DNA雙鏈斷裂而產(chǎn)生不可逆的變性；隨后出現(xiàn)N-糖苷鍵水解，使嘌呤殘基游離；最后，多聚核苷之磷酯鍵緩慢水解，僅殘留具有完整嘧啶的多聚脫氧核糖短臂。上述改變亦受溫度或離子強度的影響。加入鹽或降低溫度可穩(wěn)定氫鍵，因而可防止酸性條件下的DNA變性。然而，即使福爾馬林被氫氧化鈉中和，在室溫下DNA亦發(fā)生降解，提示福爾馬林本身即可降解DNA。福爾馬林中DNA降解的機理及其預(yù)防有待于進一步研究。

4．組織處理過程對DNA的影響我們發(fā)現(xiàn)，從常規(guī)組織處理的蠟塊中提取的DNA，其大部分分子量在100bp～1000bp之間，主要分布于100～1500bp，僅約1/3的組織所提取DNA>20kb。這除與固定劑、固定時間等因素有關(guān)外，可能的原因還有：①組織從外科切除到固定之間的時間長短不一。當組織未固定或固定不充分時，核酸酶可自由作用；②不同腫瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不發(fā)揮作用；③蠟塊貯存的時間長短不一。雖然從不同貯存時間的蠟塊中提取的DNA大小無絕對區(qū)別，但新近的蠟塊比貯存10年以上的標本所獲得的DNA分子量大�？赡芟瀴K中仍存在導(dǎo)致DNA降解的因素。

組織的浸蠟和包埋溫度過高或時間過長，均可導(dǎo)致DNA變性，而產(chǎn)生單鏈DNA片段。單鏈DNA不能被限制性內(nèi)切酶所消化，可導(dǎo)致電泳時泳動速率變慢。

三、提高DNA提取質(zhì)量的方法

1．蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織標本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是應(yīng)用了固定不充分的組織。因此，在DNA提取前應(yīng)檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結(jié)構(gòu)不清，大片出血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或?qū)�壞死部分切去后再用。盡可能地選用新近標本，緩沖福爾馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。

2．DNA提取方法學的改善為了提高石蠟包埋組織DNA提取的質(zhì)量和效益，人們從不同方面進行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化時間和DNA純化等問題上取得了進展。①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE緩沖液。固定和包埋組織由于化學修飾作用，使得DAN與蛋白質(zhì)不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時間：SDS可增至1%～2%，蛋白酶K200～500μg/ml，最高可達1mg/ml；作用時間一般為2～4天，最長可達7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不時震搖，使酶與組織充分接觸。Koshiba等發(fā)現(xiàn)，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能夠得到令人滿意的完整DNA。尿素和胍（guanidine)是DNA自然和人工交聯(lián)最有力的剝脫劑，2-巰基乙醇可干擾二硫鍵，促進蛋白變性。作者對DNA提取液進行了改良，加入高濃度（4mol/L)尿素和2-巰基乙醇gydjdsj.org.cn/wszg/。應(yīng)用此緩沖液，有效地從包埋組織中獲得高質(zhì)量DNA。②DNA釋放率對于不同的組織類型是有差異的，取決于組織細胞密度和細胞外間質(zhì)的多少。對于細胞豐富、含有很少間質(zhì)的組織（例如脾臟)，通過24h孵育80%以上DNA可釋放出來；相同量的DNA釋放對于富含致密間質(zhì)的子宮肌瘤則需要6天時間；轉(zhuǎn)移性畸胎瘤含中等細胞密度和疏松的間質(zhì)，DNA釋放率亦為中等。由此可見，對不同類型的組織DNA提取，蛋白酶K的孵育時間可作適當調(diào)整，以求最大量地獲取大分子DNA。此外，對于Dubeau等提出的DNA提取過程中分次消化步驟的必要性，也有人提出異議。因為低、中分子量的核酸存在對限制性內(nèi)切酶的消化和雜交不起作用。③Dubeau等發(fā)現(xiàn)，不適于進行酶切反應(yīng)和雜交研究的化學修飾的DNA，可通過攪起完整的DNA而被動除去，因而強調(diào)了螺旋化（spooling)在DNA純化中的重要性。該作者還發(fā)現(xiàn)延長組織固定時間的影響之一就是減少了可螺旋化DNA的量，雜交分析顯示，螺旋化DNA雜交信號強，而未螺旋化DNA信號減弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA質(zhì)量和雜交效率。但是，Moerkert 等認為未螺旋化DNA不影響進行點雜交分析。

3．避免DNA機械性損傷福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，很難達到勻漿的效果。經(jīng)常的做法是將組織切成3～5μm薄片，使每一細胞都被切開。但是，我們認為切片太薄，容易過多地將DNA切斷，影響高分子量DNA的獲得率。最好是采用15～20μm的厚切片。高濃度蛋白酶K消化2～4天，使能達到細胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并盡可能避免機械性勻漿過程造成的DNA剪切。

此外，在NDA釋放出來以后的提取過程中，應(yīng)盡可能輕柔操作，避免過多地移管。若必需移管時應(yīng)選用大口吸管。盡可能避免人為的DNA剪切。純化DNA用TE（pH8.0)溶解放4^℃保存即可，若短期不用時應(yīng)-20℃凍存，但切忌反復(fù)凍融，以免DNA降解。

四、石蠟包埋組織DNA分析的方法學

由于DNA提取方法的改善和DNA質(zhì)量的提高，幾乎所有基因分析的技術(shù)均可用于石蠟包埋組織，但目前分子病理學研究的常用方法是點雜交、Southern印跡雜交和多聚酶鏈反應(yīng)（PCR)。

1．點雜交鑒于包埋組織DNA有一定程度的降解，因而點雜交被認為是一種簡便、快速和實用的方法，特別適用于較大樣本的篩選。Dyall – smith等（1988)采用未經(jīng)抽提的蛋白酶消化產(chǎn)物直接點膜，進行點雜交分析，在3周內(nèi)對200多病例進行篩選，對陽性病例和很難解釋的弱陽性斑點，再進行原位雜交等方法作進一步證實。

2．Southern印跡雜交Southern印跡雜交是經(jīng)典的基因分析技術(shù)，已被廣泛地用于基因突變，擴增、重排和丟失等許多方面的研究。石蠟包埋組織的Southern印跡雜交分析有以下幾個方面值得注意：

（1)當所分析的酶切片段長為300～500bp時，包埋組織DNA雜交信號強度只有相同量標準DNA的10%～85%。信號強度與原始DNA大小呈正相關(guān)，最小片段DNA產(chǎn)生最弱的信號。

（2)包埋組織DNA所致的非特異性背景雜交比標準DNA為明顯。這種背景雜交的產(chǎn)生可能是由于不包含到分析基因中兩個限制性內(nèi)切酶識別位點的小片段DNA存在。

（3)由于背景雜交明顯使得信號模糊，信/噪比縮小。根據(jù)Goelz的經(jīng)驗，約有25%石蠟包埋組織不適于作Southern印跡雜交。

（4)某些限制性酶切片段的電泳速度比標準DNA稍遲緩�？赡艿脑�因是DNA直接或間接的化學改變使某些限制性酶切位點失活和/或單鏈DNA存在。

（5)由于小片段DNA的存在，故用作雜交分析的DNA量應(yīng)適當增加，以增強雜交信號。

3．PCR分析PCR技術(shù)是近年來分子生物學技術(shù)的典范，已被廣泛地用于分子病理學的各個領(lǐng)域。此技術(shù)不但特異性好和敏感性高，而且簡便、快速、模板DNA要求不高，特別適于石蠟包埋DNA的分析。

用于PCR擴增的DNA提取比較簡單，既使少量DNA樣品亦能產(chǎn)生大量特異性DNA拷貝。已被成功地用于各代木乃伊DNA的分析，小至1mm²的HE染色切片提取的DNA亦可獲得滿意的擴增，并可用于診斷。但是，為了提高PCR的敏感性和可重復(fù)性，模板DNA應(yīng)盡可能地純化，除去提取物中某些抑制PCR反應(yīng)的成份。

此外，切片過程中要注意防止污染，以免出現(xiàn)假陽性。

最近，Davis等（1993)對PCR產(chǎn)物進行單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP)分析，可以提高PCR敏感性5倍以上。SSCP分析是應(yīng)用單鏈DNA在非變性聚丙酰胺凝膠上電泳，根據(jù)序列的不同所產(chǎn)生的構(gòu)型差異來分析PCr 產(chǎn)物。此分析能檢測出小到一個堿基的差異，因而可被廣泛地用于研究點突變和基因多態(tài)性。

此外，在包埋組織的DNA提取中往往發(fā)現(xiàn)有RNA的存在。這些未加任何保護而免受降解的RNA，不可能是完整的序列。然而，此發(fā)現(xiàn)提示用福爾馬林固定的組織亦可作為Northern印跡雜交分析的可能材料來源。

五、分子病理學研究中的應(yīng)用

1．基因重排分析與淋巴瘤的診斷分子生物學技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用，目前僅限于淋巴瘤/白血病。淋巴瘤以具有特異性抗原受體基因重排的單一性細胞增殖為特征。因此，克隆性免疫球蛋白（Ig)和T-細胞受體（TCR)基因重排的檢出可作為淋巴瘤診斷的重要指標，這在國外許多實驗室已成為常規(guī)診斷技術(shù)。

Southern印跡雜交和PCR都已被成功地用于基因重排分析。此技術(shù)在下列病變的診斷和鑒別診斷中特別有意義：①惡性淋巴瘤與反應(yīng)性淋巴組織增生的鑒別。后者為多克隆性細胞增生，不能檢出或擴增出克隆性基因重排序列；②T和B細胞性腫瘤的區(qū)分：PCRβ基因重排支持T細胞源性，而Ig重鏈基因則為B細胞源性。然而，一部分病例顯示Ig和TCR基因雙重排。在這種情況下，要結(jié)合其他基因分析。若同時伴有Ig輕鏈（K或人)基因重排則支持B細胞腫瘤；同時伴有TCRr或TCRs基因重排則為T細胞腫瘤。另外，也可結(jié)合免疫分型。雙基因重排的腫瘤往往一種基因為不完全重排、不伴有相應(yīng)的抗原受體表達，故免疫表型上往往是單一的。③T細胞性淋巴瘤的診斷，T細胞腫瘤形態(tài)變化多端、免疫表型上無克隆性標記，故對此類淋巴瘤均有必要進行基因分型。④T細胞優(yōu)勢性B細胞淋巴瘤。這種腫瘤在形態(tài)和免疫表型上很難建立診斷。⑤殘留病變監(jiān)測和復(fù)發(fā)的早期診斷。此技術(shù)還可用于識別骨髓的累及、治療或骨髓移植后殘余病變的檢測，以及形態(tài)學上不能察覺的早期復(fù)發(fā)的診斷。

某些淋巴瘤/白血病所伴有的特異性染色體易位是另一種類型的基因重排標記。例如濾泡型淋巴瘤中常出現(xiàn)的t（14：18)易位，Burkitt氏淋巴瘤的t（8：14)、t（8：2)和t（8：22)易位，以及慢�；蚣绷馨籽�病中常見的t（9：33)易位。因上述基因重排在淋巴瘤中出現(xiàn)頻率不高，故診斷應(yīng)用價值不大。

2．癌基因與抗癌基因的研究分子生物學在腫瘤病理學中另一熱點是癌基因和抗癌基因的研究。自從1981年Weinberg 等首先報道人癌基因分離成功以來，至今已有50多種癌基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因普遍存在于各種生物細胞中，對于細胞的生長和分化起著重要作用。在正常情況下，其表達受到嚴格調(diào)控；病理狀態(tài)下，癌基因活化，表達失控，使細胞原有的正常生物學性狀發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細胞癌變。據(jù)報道，癌基因的結(jié)構(gòu)和功能改變見于造血系統(tǒng)、乳腺、粘膜鱗狀上皮、前列腺、肺、腎、消化道、膀胱、卵巢、消化腺、神經(jīng)系統(tǒng)和軟組織等腫瘤。

另一類基因稱抗癌基因或抑癌基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有p53、Rb、DCC、WT₁和NF₁等。其蛋白產(chǎn)物的功能是阻滯癌基因所編碼多肽的活性。因此，如果抗癌基因發(fā)生突變或功能喪失，異常的癌基因產(chǎn)物表達失控，而誘發(fā)細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤。此現(xiàn)象為見于視網(wǎng)膜母細胞瘤、子宮內(nèi)膜、結(jié)腸、食管等各部位的腫瘤。

目前，對人類腫瘤中癌基因和抗癌基因的檢測，已經(jīng)在腫瘤的分類、發(fā)病機理、腫瘤生物學行為和預(yù)后的關(guān)系等方面與腫瘤臨床密切結(jié)合起來，并正在逐漸地應(yīng)用于腫瘤的診斷、鑒別診斷和治療。

（1)癌變機理的研究：癌基因活化和抗癌基因失活在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。已有大量證據(jù)表明，至少需要兩種以上的癌基因活化的協(xié)同作用才能使正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。目前研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤有一種以上的癌基因過度表達，一種癌基因?qū)Π屑毎�的永生化起重要作用，而另一種則促進細胞的永生化。

（2)腫瘤生物學待業(yè)和預(yù)后的研究：某些癌基因突變及其產(chǎn)物的過度表達與癌細胞的分化和惡性程度有關(guān)。目前研究最多的是c –erbB –2與乳腺癌的關(guān)系。許良中等（1992)發(fā)現(xiàn)，浸潤性導(dǎo)管癌中c – erbB –2陽性表達率達67%以上，單純癌陽性率為26.5%，而全部乳癌良性病變皆陰性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，c –erbB –2 過度表達的乳腺癌預(yù)后不良，Schimmelpenning等（1992)也報告伴有c –erbB –2 擴增的導(dǎo)管內(nèi)癌易于發(fā)生周圍浸潤。此外，ras P21在乳腺癌中的表達也有上述趨勢。

（3)輔助診斷和鑒別診斷：bc1-2基因已被用于濾泡型淋巴瘤與反應(yīng)性濾泡增生的鑒別診斷，前者陽性表達率在80%以上，而后者幾乎為陰性；ras癌基因突變或過度表達有助于甲狀腺乳頭狀癌、乳腺導(dǎo)管癌、結(jié)腸腺癌等腫瘤的診斷；小細胞肺癌常伴有n –myc突變。

（4)癌細胞的組織發(fā)生：paget氏病可分乳腺外（EPD)和乳腺內(nèi)（MPD)兩種。有關(guān)paget細胞的起源問題仍有爭議。許良中（1993)觀察了c –erbB –2和p53在77例EPD和10例MPD中的表達，認為MPD中的paget細胞是來源于腺癌細胞而不是表皮的角質(zhì)層細胞。EPP中的paget細胞也來源于腺癌細胞，但這種腺癌細胞與MPD中的腺癌細胞不同，因為兩者基因表達不同。

3．遺傳病的基因診斷遺傳病的回顧性家族調(diào)查，可通過石蠟包埋組織完成。Mueller等描述1例懷疑囊性纖維化（CF)的死嬰，石蠟包埋組織是唯一的材料來源。應(yīng)用CF基因標記引物，對患兒和其父母的DNA分別進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用相應(yīng)內(nèi)切酶消化并檢測限制性片段多態(tài)性。結(jié)果顯示父母和患兒在同一位點上有意義，表明患兒遺傳有突變型CF基因，最后證實了CF的診斷。

另一種常見的遺傳病–肌營養(yǎng)不良癥（DMD)，是由Dystrophin基因的DNA序列畸變引起。Forstboefel等用該基因的已知編碼DNA序列，從一死嬰尸檢組織中得到的DNA進行選擇性PCR擴增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMD基因的一關(guān)鍵部分缺失，進而證實了DMD的診斷。同樣可通過親代DNA分析，區(qū)分遺傳性或散發(fā)性缺失。

4．病理微生物的檢測核酸雜交和PCR技術(shù)對病原微生物的檢測亦具有獨到之處，除其特異性和敏感性極高外，還可適用于石蠟切片等多種材料，且可避免因培養(yǎng)造成的病原擴散。特別是一些原位雜交和PCR診斷性試劑盒的問世，使此項檢測更加簡便易行。因此，分子生物學將是傳染病實驗室診斷技術(shù)的發(fā)展方向。這方面的應(yīng)用已有很多報道，本節(jié)　不再贅述。

5．組織來源的鑒定PCR可用于選擇性擴增一部分HLa–DQa 基因，這部分是人類基因組中高度多肽性的位點。DNA序列微小的個體差異，可被特異性cDNA探針區(qū)分。此基因在人群中的正常變異是有圖譜的，故可將其用作“基因指紋”來驗證組織來源。在日常工作中偶爾遇到標本的標記錯誤，當觀察組織切片，發(fā)現(xiàn)與臨床資料不匹配時才被發(fā)現(xiàn)。Shibata等通過分析石蠟標本DNA中HLa–DQa位點解決了這一難題。另一高度多肽性的基因-低密度脂蛋白受體基因，亦可同樣用于標本的鑒定。

Dubeau等發(fā)現(xiàn)提取DNA的甲基化類型是恒定的，包埋組織仍保留其原有的特異性甲基化特征，籍此可有助于識別某些腫瘤的起源組織。

綜上所述，石蠟包埋組織DNA的提取擴展了分子生物學技術(shù)在臨床上的應(yīng)用范圍。雖然現(xiàn)在回顧性DNA分析僅用于確定少數(shù)特異性診斷，但隨著越來越多的感染性病原基因、特異性腫瘤基因和遺傳病基因的識別和克隆，相信不遠的將來基因診斷的應(yīng)用范圍會進一步拓寬，分子雜交等基因分析技術(shù)將會在病理學診斷和研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

（張建中)