幽門螺桿菌生物學(xué)性狀的研究

　　慢性胃�。˙型胃炎、胃潰瘍等)及十二指腸球部潰瘍等一類常見病、多發(fā)病，長期以來，其病因尚未闡明。1983年澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall從慢性活動(dòng)性胃炎病人胃粘膜活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)并分離出幽門螺桿菌（Helicobacter pylori Hp)后，引起了全世界消化病學(xué)與有關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)的普遍關(guān)注。幾年來，各國對Hp的研究迅猛發(fā)展，其中主要為臨床實(shí)用性研究，有關(guān)Hp生物學(xué)特征相對較少，至于Hp具體致病機(jī)理則更少。

　　我們是從1985年開始與上海市消化疾病研究所合作開展這方面研究工作的，我們開初的工作（1985～1986)主要有：①在國內(nèi)最早分離培養(yǎng)成功了Hp；②對上海地區(qū)各種慢性胃病中的Hp檢出率作了調(diào)查；③用雙盲法探討痢特靈、滅滴靈治療Hp陽性慢性胃炎的療效，并驗(yàn)證Hp感染與慢性胃病人發(fā)病關(guān)系。上述研究結(jié)果表明：①我國Hp感染率與各種慢性胃病的關(guān)系和文獻(xiàn)報(bào)道的同樣廣泛和密切；②根據(jù)Hp的檢出率與各種慢性胃病的高度相關(guān)性、Hp感染者經(jīng)適當(dāng)藥物治療后與臨床癥狀緩解，以及病理表現(xiàn)改善的密切程度，支持慢性胃病的Hp感染學(xué)說。1988年，我們又用Hp超聲粉碎的抗原以ELISA法測定了Hp感染的慢性胃炎及消化性潰瘍病人、健康體檢者和新生兒血清中的抗Hp-IgG抗體，結(jié)果表明：①B型胃炎及消化性潰瘍病人的陽性率明顯高于A型胃炎及健康體檢組；②體檢組中抗Hp-IgG陽性率隨著年齡組的增長而升高，30歲～50歲組達(dá)最高峰，70歲以上又稍有下降，③新生兒組抗Hp-IgG陽性率反比1/2歲～10歲年齡組為高，接近成人水平。其抗體可能通過胎盤來自母體中，提示Hp是后天獲得感染。上述人群中，抗Hp-IgG抗體水平調(diào)查的結(jié)果又增強(qiáng)了慢性胃病的Hp感染之說。

　　1987年我們微生物學(xué)教研室以“彎曲菌樣細(xì)菌(Campylobacter-like organisms,CLOS)的生物學(xué)地位及致病物質(zhì)的研究”課題名稱申請得到國家自然科學(xué)基金的資助。由此對Hp的生物學(xué)性狀作了比較全面系統(tǒng)的研究，企圖對Hp的生物學(xué)地位及致病機(jī)理作一些探討。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　�、贅�(biāo)本1985年5月～1989年10月分別取自上海市仁濟(jì)醫(yī)院、紡二醫(yī)院、新華醫(yī)院有上消化道主述病人的內(nèi)窺鏡檢查標(biāo)本。②菌種Hp均分自病人。除藥敏試驗(yàn)和與空腸彎曲菌的交叉反應(yīng)者外，都以88065，88073，88082，88109，88152五個(gè)菌株作為代表進(jìn)行試驗(yàn)研究。

　　參考菌種：空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni,CJ)CJ-3276株和結(jié)腸彎曲菌F（Campylobacter coli,CC)CC-3278株由法國Borbeaux兒童醫(yī)院Megraud 博士惠贈(zèng)，空腸彎曲菌CJ-S131由蘇州醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus,CF)日本大阪大學(xué)微生物學(xué)研究所三輪谷俊夫教授惠贈(zèng)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 光學(xué)顯微鏡檢查 取胃粘膜活檢標(biāo)本或菌種培養(yǎng)物在潔凈玻片上涂薄膜。自然干燥，加熱固定，革蘭染色后油鏡檢查。另取胃粘膜活檢標(biāo)本作石蠟包埋切片，四苯胺蘭（touidine blue)染色鏡檢。

　　1.2.2 分離培養(yǎng) 空腸彎曲菌選擇性基礎(chǔ)瓊脂（上海市衛(wèi)生防疫站生產(chǎn))中補(bǔ)充以10%羊血和1%可溶性淀粉，并每1000ml培養(yǎng)基中加入1ml萬古霉素（10mg/ml)，1mlTMP(5 mg/ml)和1mloctidione(5 mg/ml)制成平板后，置Queue三氣培養(yǎng)箱（美國產(chǎn))，氣體調(diào)節(jié)至5%O2，85%N2和10%CO2，37°C培養(yǎng)3d后觀察。

　　1.2.3 生化鑒定 主要參考 Cliodna等方法：①氧化酶反應(yīng) 用竹簽挑取血平板上可疑菌落至已被1%鹽酸二甲基對苯二胺（E.Mer-ck,Darmstadt產(chǎn)品)溶液浸透、并預(yù)先干燥過的濾紙上，10s內(nèi)出現(xiàn)深紫紅色為陽性。②觸酶反應(yīng) 用含3%H2O2液的毛細(xì)玻管碰觸血平板上菌落，有氣泡升起為陽性。③尿素酶反應(yīng) 將含有菌落棉拭插入尿素肉湯中，30s內(nèi)棉拭呈粉紅色為陽性。④DNA酶試驗(yàn) 在含有甲葳胺蘭核酸瓊脂的平皿上打孔后，將細(xì)菌懸液加于孔中，37°C培養(yǎng)2h后觀察結(jié)果。小孔周圍出現(xiàn)透明小圈者為陽性。⑤堿性磷酸酶反應(yīng) 用0.02mol/LpH8.0Tris-HCL洗下細(xì)菌菌落。加入0.5ml1%磷酸對硝基苯脂（Beckman產(chǎn)品)，37°C水浴1 h ,觀察結(jié)果。呈黃色者為陽性。⑥亮氨酰胺肽酶反應(yīng) 取小試管2只，1只測定管加待測菌液（約3×1010cfu/ml)0.05ml，另1只空白對照管加H2O0.05ml。然后各加0.2M磷酸緩沖液（pH7.2)0.45ml和基質(zhì)液（亮氨酰-β-萘胺鹽酸20mg溶于H2O25ml，加入0.2mol/LpH7.2的磷酸緩沖液25ml，充分混勻)0.5ml。37°C水浴30min后各加入40%三氯醋酸0.2ml。充分混勻后4000r/min離心沉淀10min。從測定管和空白對照管中各取上清液0.5ml分別裝入另2只試管中，并分別加2NHCI0.5ml和0.2%NaNO20.5ml。充分混勻，室溫（20°C)中靜置10min。再各加0.5%氨基磺酸胺10ml�；靹蚝螅�室溫（20°C)靜置10min 。最后各加N-萘乙烯二胺二鹽酸鹽溶液[稱取N-（1-萘)乙烯二胺二鹽酸（分析純，瑞士，Lichtemptindicht生產(chǎn))100mg，溶于95%乙醇200ml中，冰箱保存可穩(wěn)定1個(gè)月。臨用時(shí)，以95%乙醇稀釋10位后使用] 2.0ml。20min后觀察結(jié)果。呈紫色為陽性。⑦馬尿酸鹽水解試驗(yàn) 接種1環(huán)48hCJ/CC培養(yǎng)物或72hHp培養(yǎng)物于0.4ml含1%馬 尿酸鹽水溶液的小試管中，混勻，放置37°C水浴2h，再輕輕倒入0.2ml茚三酮試劑（3.5g茚三酮溶于100ml丙酮:丁醇=1:溶液)于各管。置37°C水浴，經(jīng) 10min后看結(jié)果。深紫色為陽性反應(yīng)。

　　1.2.4 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 用瓊脂稀釋法測定13種抗菌物（青霉素G、鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、先鋒霉素V、四環(huán)素、痢特靈、滅滴靈、TMP、潔霉素、次硝酸鉍、多粘菌素B、萬古霉素)對30個(gè)（Hp)菌株（Hp菌株號：85025，85084，85114，85117，85120，85143，85187，85485，85507，85508，85524，85553，85558，85560，85562，85568，85596，85595，85621，85623，85625，85629，85634，85639，85643，85647，85648，85660，85663，85677)的最小抑菌濃度（Minimal inhibition Concentration,MIC)。①菌液準(zhǔn)備：待測菌株落分別用生理鹽水洗下，比濁調(diào)整至108fu/ml。②藥敏平板制備：分別取200ul不同種類、不同濃度的抗菌藥物稀釋（抗菌藥物的濃度為0.05μg～100μg/ml的對倍稀釋液的對倍稀釋系列)置于空的無菌平皿（φ9 cm)中。每只平皿加入加熱融化的血瓊脂10ml，輕輕搖動(dòng)使培養(yǎng)基與抗菌藥物均勻混合。待瓊脂凝固后備用。③細(xì)菌拉種：用多點(diǎn)接種器（M2T-P)將菌液點(diǎn)種于上述每只藥皿平板上。每個(gè)平板點(diǎn)種25個(gè)菌種。置微需氧環(huán)境中培養(yǎng)3d后觀察結(jié)果。如Hp在某個(gè)抗菌藥物濃度的培養(yǎng)基上生長，而在前一個(gè)大一倍的嘗試的培養(yǎng)基上不長，則以此前一個(gè)平板中的抗菌藥物嘗試為該菌的MIC。

　　1.2.5 菌種保存 挑取3～5環(huán)分純的Hp菌種（菌號：88064，88065，88073，88075，88077，88082，88099，88108，88109，88152，88223，85289，85682，85688)于裝有滅菌脫脂牛奶的Eppendorf塑料離心管，置-70°C凍存。經(jīng)1年后復(fù)蘇鑒定。

　　1.3 超微結(jié)構(gòu)的研究

　　以Hp88065，88073，88082，88109，88152菌株及CJ-3276，CJ-131、CC3278參考菌株制成負(fù)染和超薄切片，置H-500透射電鏡下觀察。取新鮮采集的胃粘膜活檢標(biāo)本經(jīng)固定后在臨界點(diǎn)下干燥，真空涂金。在JEOL JSM0S40掃描電鏡下觀察。

　　1.4 Hp的DNA G+Cmol%與菌體脂肪酸組成測定

　　1.4.1 細(xì)菌DNA中G+Cmol%含量的測定 主要參贊丁鑒等高壓液相色譜測定。①Hp DNA的提取；將細(xì)菌懸液經(jīng)4000e/min×15離心沉淀，用0.15mol/LnaCI-0.1M EDTA pH8.0 溶液（SE液)洗一次后，重懸浮于10mlSE液中。加溶菌酶，使終濃度為2％的SDS，放60°C水浴15min。用等體積酚／氯仿·異戊醇（體積之比為3/1)抽提二次后，再用等體積氯仿/異戊醇（體積之比為24/1)和等體積乙醚各抽提一次。水相在pH7.8,10mmol/L Tris-HCI,1mmol/L ED-TA中透析4°C過夜。透析后的抽提液中加入經(jīng)100°C、15min處理的Rnase，使終嘗試為200ug/ml，37°C,2h。加蛋白酶K，終嘗試為200ug/ml，37°C輕搖2h。用等體積酚/氯仿（體積之比為1/1)和等體積氯仿·異戊醇各抽提一次。水相加NaCl和0.1M，溶解后，加入2倍體積的冷無水乙醇�；靹蚝�，①-20°C，13000g×30min，得DNA沉淀。②游離堿基的制備：在DNA沉淀物中加入100μl72%高氯酸，使完全溶解后，移入安瓿中，熔封管口。100°C水解1h，放入4°C冰箱待用。③高壓液相色譜測定：用Shimadzu LC-4A高壓液相色譜義；柱為不銹鋼制，4.6mm×250mm；填充材料為Nucleosil C18,5um。流動(dòng)相為0.1mol/L pH3.9甲酸鈉，流速0.8ml/min。壓力120kg/cm2,柱溫40°C檢測器為UV254nm,0.02AuFs。④標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用電子稱（Sartorius research)分別準(zhǔn)確稱取腺嘌呤（A，,英國BDH產(chǎn)品)，嘌呤（G，Sigma產(chǎn)品)，胞嘧啶（C，中科院生化所產(chǎn)品)和胸腺嘧啶（T，上海市化學(xué)試劑公司產(chǎn)品)。加數(shù)滴磷酸，以高壓液相色譜儀標(biāo)定出峰位置。⑤堿基物相對克分子樣正因子的測定和G+Cmcl1%的計(jì)算：

表1 四種堿基的分子量、毫克/分子濃度及相對克分子較正因子

　　a..相對克分子校正因子（f′m)的測定標(biāo)準(zhǔn)A，T，G，C混合溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測定每個(gè)峰面積。按下式計(jì)算A、T、G、C的相對克分子樣正因子（fm)。

　　式中A峰為面積，m為進(jìn)樣量，M為分子量，下標(biāo)S為內(nèi)標(biāo)物（本實(shí)驗(yàn)以A為內(nèi)標(biāo)物)，i待測堿基。

　　b.G+Cmol%計(jì)算：10μl各樣測樣品進(jìn)樣后，測出峰面積，乘上相對克分子校正因子（f′m)，然后歸一化，用下式

　　計(jì)算，求得其分子百分?jǐn)?shù)。

　　1.4.2 細(xì)菌菌體脂肪酸組成分析 主要參考I toh等方法①標(biāo)準(zhǔn)品的處理 在脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma產(chǎn)品，EC10A偶炭鏈脂肪酸，OC-9奇炭鏈脂肪酸，UN-10不飽和脂肪酸)中加入4ml25%鹽酸-甲醇后，再加入1ml NaCl溶液。用4ml已烷：乙醚=1:1（體積比)溶液萃取3次。有機(jī)相用N2吹干，最后用0.5ml已烷定量。取1μl作色譜分析，標(biāo)定各峰位置。②樣品的處理：在干重為10mg～20mg的細(xì)菌中加入生理鹽水1ml，混均后轉(zhuǎn)入磨口玻璃管中。加入含15%NaOH的水-甲醇（體積比為1:1)溶液2～4ml后，在100°C水浴中加熱30min。稍冷后，加入6NHCl,使溶液pH達(dá)2.0。加入25%HCl-CH3OH溶液5ml，100°C水浴加熱15min。冷卻后，用N2吹干HCl至原體積的一半。加入1ml飽和NaCl溶液。用12ml1:1的乙醚-已烷溶液分三次萃取，萃取后的有機(jī)溶液放入有塞磨口離心管中。70°C水浴蒸發(fā)溶液至1ml左右。用N2吹至0.5ml左右，加入少量Na2SO4去除殘余水分。4000r/min離心15min后，取上層有機(jī)相，加入1ml已烷溶解。取1μl作色譜分析。③氣相色譜測定條件：色譜儀為日本島津公司的GC-9A，色譜柱為2%的OV-101，80～100目，Chromosorb AW，W，DMCS。操作條件：柱溫180°C～230°C，程序升溫，升溫速率4°C/min，進(jìn)器溫度和檢測器（FIS)溫度為260°C，RANGE=102。氮?dú)鈮毫��?.4kg/cm2，速度為30ml/min，空氣壓力為0.3kg/cm2。

　　1.5 Hp菌體蛋白電泳與與CJ間抗原交叉反應(yīng)

　　1.5.1 Hp菌體蛋白電脈 ①樣品的準(zhǔn)備:將細(xì)菌菌苔用生理鹽水洗下.在超聲粉碎儀上粉碎(dute cycle 50%,time 6min。Output Control 8,pulse)。然后10000r/min離心10min，4°C。上清蛋白定量。用0.01ml/LpH7.2磷酸緩沖液稀釋至2mg/ml，-20°C保存。②SDS-PAGE：主要參考Blaser的方法。用pH8.3 Tris-甘氨酸作電泳緩沖液：分離膠濃度為10%；每份樣品加20μl；以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（MV17500～94000，中科院上海生化所東風(fēng)試劑廠產(chǎn)品)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白；在10mA恒流下電泳；考馬斯蘭G～250染色。

　　1.5.2 用Hp耐熱抗原致敏的紅細(xì)胞與CJ的Penner分型血清作間接血凝，測定Hp與CJ之間的交叉反應(yīng)。①CJ Penner分型血清的準(zhǔn)備：CJ的Penner分型血清（由衛(wèi)生部藥品生物制品檢驗(yàn)所、上海衛(wèi)生防疫站及蘇州醫(yī)學(xué)院微生物教研室聯(lián)合研制)由蘇州醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。先將25個(gè)免疫血清分別根據(jù)特異性較強(qiáng)或交叉反應(yīng)較多的血清組合在同一多價(jià)血清內(nèi)。共分6組（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ)，Penner5，29，45，52型不包括在多價(jià)血清內(nèi)，每種血清使用時(shí)效價(jià)稀釋成1:1280二種濃度備用。②Hp耐熱抗原致敏的紅細(xì)胞的制備a.Hp耐熱抗原制備：將血平板上洗下的28種Hp菌株（菌號：85135A，85158，85130，85132，85155，85138，85084，85067，85031，85070，85093，85120，85157，85071，85123，85141，85113，85134，85070，85117，85142，85134B，85085，85114，85118，85030，85111，85117)的菌液，均調(diào)整至9×109／ml濃度，100°C加熱1h，3000r/min離心沉淀20min。取上清備用。B.羊紅細(xì)胞制備：取新鮮脫纖維蛋白羊血，離心沉淀，棄上清用pH7.0磷酸緩沖液洗3次后，3000r/min離心沉淀10min，棄上清。用PBS配成1%紅細(xì)胞懸液。C.致敏：分別將28種1ml的耐熱抗析與等量1%羊紅細(xì)胞懸液混合均勻置37°C水浴1h。3000r/min離心10min。棄上清。用PBS洗三次，最后配成0.5%致敏紅細(xì)胞懸液。③交叉凝集反應(yīng)：用96孔U型塑料板，縱向分別加入Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ組多價(jià)血清及5，29，45，52型的單價(jià)血清。橫向單行為1:640濃度的血清0.25μl，雙行為1:1280濃度的血清0.25μl。如此準(zhǔn)備好8塊已添加CJ分型血清的96孔塑料板。然后在每兩行為一組的CJ分型血清中加入一種Hp耐熱抗原致敏的紅細(xì)胞懸液，每孔0.25μl。待28種Hp耐熱抗原致敏的紅細(xì)胞懸液均加妥后，將96孔塑料板均置微型振蕩器上振蕩1min～2min ,使充分混勻。置37°C孵育2h后觀察結(jié)果。根據(jù)凝集程度，以++++、+++、++、+、± -符號記錄結(jié)果。以血清最高稀釋度呈現(xiàn)“++”以上程度凝集者為陽性。如上交叉凝集反應(yīng)中先以多份血清進(jìn)行粗篩，若效價(jià)超過1:1000者，再以單價(jià)血清進(jìn)行分型，效價(jià)≥1:1280者作為陽性。

　　2 結(jié)果

　　2.1 Hp的基本生物學(xué)性狀

　　2.1.1 光鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu) Hp為“S”形、“U”形或弧形桿菌。菌體寬0.3～0.5μm,長1.5～5.0μm。大多大小均勻，形態(tài)典型，革蘭染色陰性。Hp較CJ/CC稍粗，兩端鈍圓。在陳舊培養(yǎng)物中，Hp常變成圓球體，在革蘭染色下呈現(xiàn)大小不一、染色深淺不均，周圍界較模糊的特征。在胃粘膜活檢標(biāo)本直接涂片中，多數(shù)存在于著色較淺的粘液帶中，常呈魚貫狀排列，在Hp密集處，甚少雜菌混雜，在著色的組織液背鏡下，Hp菌全周圍常呈現(xiàn)有微莢膜樣結(jié)構(gòu)。在病理組織切片中可見，Hp多數(shù)存在胃粘膜上皮細(xì)胞表面，特別是在胃小凹。在病理切片中尚可見到在胃粘膜表面有Hp存在的附近部位常有大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤。在胃的腸腺化生區(qū)域很難找到Hp，但是在十二指腸的胃化生區(qū)域卻能找到Hp。

　　2.1.2 菌落特征及細(xì)菌動(dòng)力 在微需氧條件下，經(jīng)37°C72h培養(yǎng)，Hp形成較小菌落，直徑＜1mm，呈灰白或灰色，邊緣整齊，隆起的圓形菌落。打開平皿有一股特異的氣味。新鮮的菌落制成濕片在暗視野下可見Hp呈螺旋狀迅速向前的運(yùn)動(dòng)。亦可見翻滾運(yùn)動(dòng)。

　　2.1.3 生化反應(yīng)特征 Hp的生化反應(yīng)特征見表2。Hp均有氧化酶、觸酶、尿素酶、DNA酶、堿性磷酸酶和亮氨酰酞酶，而馬尿酸鹽試驗(yàn)均陰性，CJ和CC僅有氧化酶和觸酶，而CJ-S131能分解馬尿酸鹽。

　　2.1.4 Hp對抗生素的敏感性 25株Hp對13種抗菌藥物的藥敏性見表3。

表2 Hp、CJ和CC生化反應(yīng)

表3 25株Hp對13種抗菌藥物的藥敏結(jié)果

　　從表中可知所有被檢的Hp菌株對紅霉素、鏈霉素、四環(huán)素、慶大霉素、青霉素G及痢特靈敏感，其中特別是四環(huán)素、青霉素G和痢特靈的敏感性尤甚，MIC90分別是0.2,0.1及0.2。MIC50均＜ 0.05。Hp對TMP、多粘菌素B、萬古菌素及滅滴靈耐藥，大部分菌株的MIC均＞100。

　　2.1.5 菌種保存 15株Hp菌株，經(jīng)-70°C冰箱保存一年后復(fù)蘇，14株存活，對存活的14株作直接涂片革蘭染色，油鏡檢查，其中的13株形態(tài)不變，1株成圓球體。我們又對這13株進(jìn)行了氧化酶、觸酶、尿素酶、DNA酶、堿性磷酸酶試驗(yàn)，13株Hp陽性，這與保存前相同。

　　2.2 Hp的超微結(jié)構(gòu) 從不同病人胃粘膜上分離得Hp的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致,呈”S”形彎曲、弧形或稍直，偶見分枝狀。一般表面較光滑，一端或二端（多數(shù)為一端)具有2～6條帶鞘鞭毛，長度稍長于菌體。帶鞘的鞭毛直徑在30mm左右。每一鞭毛基部與菌體細(xì)胞膜上直徑約50mm的圓球狀結(jié)構(gòu)相連。菌體末端鞭毛基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)，有一寬達(dá)200mm～400mm的電子密度明顯降低區(qū)域，其基底部無明顯的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)界限。在Hp負(fù)染標(biāo)本中，部分菌株在菌體周圍可見大小均一、排列整齊的上百個(gè)“指”狀突起，似直接為外膜的組成部分，與菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)無明顯直接關(guān)系。在參考菌株中，CJ與CC末端呈圓錐體樣，稍尖，頂端明顯地呈吸盤樣結(jié)構(gòu)。CJ與CC均有單根無鞘端鞭毛從頂端的吸盤樣凹陷的中心伸出。鞭毛根部均未見電子密度明顯降低區(qū)域。

　　在胃粘膜活檢標(biāo)本的超薄片中可見：一般情況下，胃粘膜上皮與粘液層間不存在細(xì)菌。若出現(xiàn)細(xì)菌，常為大小、形態(tài)較統(tǒng)一的、都呈彎曲樣特征的菌群。多聚居在胃小凹中或上皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞連接處，亦常常鑲嵌在微絨毛之間。偶見Hp在局部的胃粘膜上皮上定位似有明顯的方向性。Hp與粘膜上皮的粘附方式有三種：Hp通過鞭毛頂端直接插入或粘附在胃粘膜上皮細(xì)胞表面；Hp菌體懷胃上皮細(xì)胞間保持一定的間距，借無數(shù)的細(xì)絲狀菌毛樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使兩者互相粘附；Hp菌體的部分細(xì)胞壁與胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜直接相貼粘附，二者間幾無間距。最多見的是第二形式，有時(shí)同一細(xì)菌可同時(shí)出現(xiàn)兩種或以上粘附形式。Hp粘附聚居外的上皮細(xì)胞除微絨毛明顯減少或消失外，多數(shù)情況下很少發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞病理學(xué)變化。胃粘膜上皮表面有Hp粘附的鄰近區(qū)域，往往有炎性細(xì)胞的浸潤和滲出。胃粘膜上皮細(xì)胞中尚可偶見對Hp的吞噬現(xiàn)象。

　　2.3 Hp的DNA+Cmol%和菌體脂肪酸組成

　　2.3.1 Hp的DNA G+C MOL%含量測得的Hp、CJ/CC DNA G+C mol%含量見表4

表4 Hp CJ/CC DNA G+C mol%含量

　　2.3.2 Hp ,CJ/CC菌體脂肪酸的組成 Hp 的脂肪酸組成主要是十九碳環(huán)丙烷酸(19:0cyc)、十八碳酸（18:0)、十八碳烯酸（18:1)和十四碳酸（14:0)，CJ/CC的脂肪酸組成主要是十六碳酸（16:0)、十六碳烯酸（16:1)和十八碳烯酸（18:1，表5)。

表5 Hp,CJ/CC菌體脂肪酸組成

　　2.4 Hp菌體蛋白電泳與CJ分型血清間的交叉反應(yīng)

　　2.4.1 CP菌體蛋白SDS-PAGE Hp的主要條帶Mr約為25100，28200，44700，62000，70800，81900，12600七條。CJ/CC條帶相似，其主要條帶Mr約為63000，89100和100000。

　　2.4.2 CP與CJ抗原交叉反應(yīng) 可見除CJ-22502免疫獲得的Penner45型血清與絕大部分Hp菌株（28株中的19株)及PennerV組多價(jià)血清與Hp-85607有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)外，其余幾乎無免疫學(xué)上的交叉（表6)。Hp-85067與V組多價(jià)血清的因子血清的反應(yīng)結(jié)果見表7。

表7 Hp-85067與V組因子血清間的抗原抗體交叉反

　　3 討論

　　3.1 Hp的生物學(xué)地位 雖然Hp引起的世界性關(guān)注及人們對其廣泛研究是在1983年以后，但早在1847年 Bottcher已在人胃中發(fā)現(xiàn)了螺形的細(xì)菌，隨后人們又從許多動(dòng)物-狗、大鼠、貓的胃中發(fā)現(xiàn)類似細(xì)菌。1906年又從潰瘍性胃癌病人的胃內(nèi)容物中找到這類細(xì)菌。其他一些報(bào)告證實(shí)在健康人中不易發(fā)現(xiàn)它們。1939年 Doenges在242例人胃尸檢的染色標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)有43%存在數(shù)種不同類型的螺形菌，但不明確這些菌與各種胃病間的相互關(guān)系。1954年P(guān)almer在1000例胃活檢標(biāo)本中未能證實(shí)上述報(bào)告，認(rèn)為前人發(fā)現(xiàn)地螺形菌系吞入或死后污染所致。1975年Steer和Colin-Jones報(bào)告了胃潰瘍病人胃粘膜上出現(xiàn)細(xì)菌，經(jīng)分離培養(yǎng)，結(jié)果是綠膿桿菌。后人仔細(xì)觀察該文圖片，認(rèn)為胃粘膜上的細(xì)菌是一種與綠膿桿菌無關(guān)的螺形菌。在同一時(shí)期，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種動(dòng)物胃中存在有內(nèi)源性尿素酶活性。最早是1924年有Luck和Seth描述的，后在1955年Korngerg和Davies的綜述中斷定胃的尿素酶主要存在于胃體部，且是細(xì)菌源性的。在人類胃的研究中證實(shí)了這種酶的存在與潰瘍病之間的關(guān)系，有些病人還成功地利用了尿素進(jìn)行了治療。

　　1983年Warren從慢性活動(dòng)性胃炎活檢標(biāo)本的胃粘膜上皮表面發(fā)現(xiàn)了一種未經(jīng)鑒定的彎曲狀細(xì)菌，Marshall又用彎曲菌屬的分離培養(yǎng)技術(shù)從幽門的活檢標(biāo)本中分離培養(yǎng)成功了該菌。由此，曾先后命名為GCLOs和Hp。1984年Langenberg并發(fā)現(xiàn)原先認(rèn)為的胃中內(nèi)源性尿素酶即由此菌產(chǎn)生。因此在1984年以前人們對Hp的生物學(xué)性狀了解得比較少，只知它在光鏡下呈螺形，分離培養(yǎng)需微氧條件，與彎曲菌屬的代表菌種-空腸彎曲菌相似，只是它有較強(qiáng)的尿素酶活性與空腸彎曲菌不同。此后這種細(xì)菌與各種慢性胃病間的密切相關(guān)性為世界各地的學(xué)者所進(jìn)一步證實(shí)。由此掀起了一股對Hp研究的熱潮。

　　在國內(nèi)，我們對Hp表型特征—生物學(xué)性狀的系統(tǒng)研究是比較早的，其結(jié)果已如前述。根據(jù)這些結(jié)果，Hp確實(shí)與彎曲菌屬的代表菌種——CJ有一些共同或相近之處，例如光鏡下的形態(tài)相似，都需要微氧的條件分離培養(yǎng)，營養(yǎng)要求大致接近。培養(yǎng)的最適溫度雖有差別，但都能在37°C生長，都能產(chǎn)生觸酶、氧化酶，均不能利用糖類，能產(chǎn)生微量的H2S。對各種抗生素的敏感譜與CJ相比，絕對值雖有一些出入，但總趨勢大致相仿。Hp的DNAG+Cmol%與CJ基本相同，甚至重疊在同一范圍內(nèi)。從這些特征，Hp與CJ同歸一屬似乎無可置疑。

　　俟后，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Hp與CJ間存在著更多的本質(zhì)上差別：①有一些重要的生化反應(yīng)與CJ明顯不同，例如尿素DNA酶，堿性磷酸酶、亮氨酰胺酞酶等，Hp均為陽性，而CJ/CC均為陰性，這與國外文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。②更重要的是在超微結(jié)構(gòu)上Hp與CJ/CC存在著不同，特別是鞭毛、鞭毛的根部和菌體末端的外形其內(nèi)側(cè)具有“極膜”，曾提出它可能與水螺菌（Aquaspirillum，AS)同屬。但不久發(fā)現(xiàn)AS為雙極叢毛菌，一般每端只有1～2根鞭毛，Hp雖偶也可見雙極鞭毛，但多數(shù)情況下只有一端有鞭毛，且為有鞘鞭毛，數(shù)量多到6根。更重要的原因是因?yàn)锳S的DNA G+Cmol%為49～66，與Hp相關(guān)甚大。很快就不再有人提及。③從所測的Hp菌體脂肪酸組成來看，Hp與CJ/CC之間亦存在著明顯差別，它們的主峰是各不相同的，這一特征與國外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，只是我們Hp的幾個(gè)主峰間的相對值與國外報(bào)道者略有上下，推測可能是地方菌株之間的差異。④按菌體蛋白電泳的主要蛋白條帶，Hp與彎曲菌屬的主要代表菌種之間亦存在明顯的不同，Hp有7條主要條帶，CJ/CC僅有3條，其中只有分子量為63000與89100的2個(gè)條帶基本相同。⑤根據(jù)Hp耐熱抗原與CJ的Penner分型血清的交叉反應(yīng)，它們之間亦不存在有明顯的交叉抗原，其中有一個(gè)值得討論的問題是由CJ22052菌株免疫得的Penner45型血清與28株Hp菌之間有18株發(fā)生明顯交叉反應(yīng)。我們深感這一現(xiàn)象奇特，特地對22052菌株作了深入一步的研究，發(fā)現(xiàn)它在基本生物學(xué)性狀方面確實(shí)與CJ類似，但在電鏡下其菌體末端及鞭毛的特征與C明所不同。更重要的是DNA G+Cmol%僅有27.8，明顯地超越彎曲菌屬范圍。因此，若22052菌株不屬于彎曲菌屬，則Hp與CJ之間基本上不存在耐熱抗原的交叉。至于Hp85067菌株與的Penner26，34，35型血清之間的交叉凝集原因未明，有待進(jìn)一步作出解釋。

表8 Hp與CJ/CC.CF菌體末端擴(kuò)鞭毛的超微結(jié)構(gòu)比較

　　*國外文獻(xiàn)中亦有同樣報(bào)道，其他特征尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

　　綜上所述，從Hp的各方面的表型特征來看，Hp與彎曲菌屬的代表菌各：CJ22052菌株菌體末端超微結(jié)構(gòu)（×60000)－CJ、CC之間，差異性多于共同性，且其差異點(diǎn)比共同點(diǎn)更具有本質(zhì)性。因此，我們贊同國外個(gè)別學(xué)者提出的Hp不歸入彎曲菌屬，而宜另立一個(gè)新屬的主張。

　　至于Hp究竟應(yīng)歸入哪屬細(xì)菌，Romaniuk從分析Hp，多種彎曲菌屬細(xì)菌和產(chǎn)琥珀酸沃林菌(Wolinella succinogenes,WS)等的16s rRNA核苷酸序列得出結(jié)論，認(rèn)為Hp與彎曲菌屬關(guān)系較遠(yuǎn)，而與WS關(guān)系較近，似乎應(yīng)與WS同歸一屬。但Hudson則認(rèn)為Hp在DNAG+Vmol%(36%～38%對 46%～49%)，脂肪酸組成，極性脂質(zhì)（polar lipid)，總蛋白電泳譜和它同時(shí)具有MK-6及TPQ-6方面與WS不同，因此不宜歸入沃林氏屬，他認(rèn)為根據(jù)Hp的培養(yǎng)和形態(tài)的基本特征仍應(yīng)歸入彎曲菌屬為宜。遺憾的是迄今還沒有一個(gè)比較統(tǒng)一的能夠應(yīng)用于所有細(xì)菌的細(xì)菌學(xué)命名原則，因此對有一些難于命名的細(xì)菌免不了會(huì)引起一些爭論。雖然現(xiàn)在對有一些細(xì)菌的研究已經(jīng)開始邁入了分子遺傳學(xué)的領(lǐng)域，但是當(dāng)前以表現(xiàn)型特征作為分類的主要依據(jù)仍然無可置辯地具有更現(xiàn)實(shí)的意義。雖然幾乎收集了當(dāng)今世界上彎曲菌屬所有的15種菌種，甚至包括Hp和WS，進(jìn)行了16s r RNA核苷酸順序的分析 。根據(jù)同源性的程度不同將它們分成三群，可是他不得不承認(rèn)由于缺少對彎曲菌屬各種菌種表現(xiàn)型特征的全面了解和也由于沒有將所有的細(xì)菌都用同樣的試驗(yàn)和同樣的方法比較過，因此難于對三群細(xì)菌作出適當(dāng)?shù)膶ｉT的描述。Good-win認(rèn)為由于Hp在臨床上的重要性，急需把它命名學(xué)地位及早地確定下來，他對Hp、WS和彎曲菌屬細(xì)菌作了超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)、菌體脂肪酸組成、甲苯醌、生長特征和酶的活力五個(gè)方面的表現(xiàn)型特征作了研究，他的結(jié)論是Hp不應(yīng)歸入沃林菌屬，他提出給它命名為Helicobacter pylori（暫譯為幽門螺桿菌)。我們的意見偏向于贊同他的意見，因?yàn)槲覀円鄬σ徊糠旨?xì)菌作了系統(tǒng)的表現(xiàn)型特征的研究，除了甲苯醌我們沒有做以外，我們還做了DNA G+Cmol%，菌體蛋白蛋電泳分析和與CJ的Penner分型血清之間交叉反應(yīng)的研究，大部分結(jié)果都表明，Hp與CJ之間有明顯的不同。

　　3.2 Hp的致病性 自從Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)Hp后，世界各地學(xué)者相繼從各種慢性胃病及十二指腸潰瘍病人的活檢標(biāo)本中找到了Hp，且檢出率都很高，從而初步確定了Hp與各種慢性胃病的密切相關(guān)性。1985年Marshall按照Koch的病原體致病性原則，吞服了Hp菌液作了自身感染實(shí)驗(yàn)。二位學(xué)者先后都找到了Hp在自身引起急、慢性胃炎的證據(jù)。1987年Krakowka又以悉生小豬(Gnotobiotic piglet)口飼Hp菌液液造成Hp感染的動(dòng)物模型。至此，Hp直接或間接與各種慢性胃病有關(guān)已得到大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。但Hp的致病物質(zhì)和致病機(jī)制，迄今尚未闡明。我們從超微結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)了一些在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未作報(bào)道的現(xiàn)象，并結(jié)合光鏡下的觀察所見和一些有關(guān)文獻(xiàn)，對Hp的致病機(jī)制或致病過程作出如下推斷。

　　胃是人們對攝入的食物徹底消化前進(jìn)行預(yù)處理的重要器官。在預(yù)處理過程中，偽造胃壁肌肉收縮和舒張的物理和機(jī)械作用使食物在胃中受到胃酸和胃蛋白酶的強(qiáng)烈化學(xué)作用而得到初步消化。本來胃的這種強(qiáng)力的縮舒運(yùn)動(dòng)及強(qiáng)酸，酶類作用對胃壁本身就可能造成損傷作用，但由于在胃壁粘膜表面有一層較厚的、且在不斷代謝更新的不溶性粘液連續(xù)層存在，且在其表面尚有可溶性粘液層起著滋潤作用，因而保護(hù)了胃粘膜。為何經(jīng)口入胃的過路細(xì)菌很多，而獨(dú)有Hp能透過不溶性粘液層定居于胃粘膜上皮表面？為何Hp對人胃的感染率這么高，而在不溶性粘液層下胃粘膜上皮表面幾乎找不到有第二種細(xì)菌的大量存在？為何一個(gè)人一旦被Hp感染后，Hp能長期在胃中持續(xù)存在？為何用有效抗生素治療常不能徹底殺滅胃粘膜上的Hp？所有這些問題都說明Hp的感染有其獨(dú)特性。根據(jù)我們所觀察到的Hp與胃粘膜之間有關(guān)系特別是Hp的三種粘附現(xiàn)象，我們提出Hp感染過程的假說如下。

　　第一步，Hp利用其特征性的菌體和鞭毛結(jié)構(gòu)穿透不溶性粘液層，當(dāng)Hp隨食物進(jìn)入胃中，首先偽造其鞭毛與胃粘膜表面的不溶性粘液層發(fā)生親和性吸附。在不斷運(yùn)動(dòng)著的胃壁上初步找到了一個(gè)落腳點(diǎn)。然后借其菌體的螺形結(jié)構(gòu)，以及一端有數(shù)根象推進(jìn)器樣活潑運(yùn)動(dòng)的鞭毛使它在粘稠的不溶性液層中自由泳動(dòng)。Venables報(bào)道，胃粘膜上的不溶性粘液層的化學(xué)結(jié)構(gòu)是由二硫鍵連接的四個(gè)同等大小的亞單位組成的多聚體糖蛋白構(gòu)成的。每一個(gè)亞單位以蛋白質(zhì)為核心，四周圍繞有碳水化合物的側(cè)鏈，形似“瓶刷狀”。 Hp利用其菌體及鞭毛結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)可在這種平行排列的“瓶刷狀”結(jié)構(gòu)中作螺旋形的向前運(yùn)動(dòng)。

　　Hazell曾在模擬的粘稠環(huán)境中發(fā)現(xiàn)Hp比同樣具有鞭毛的大腸桿菌的泳動(dòng)速度快10倍。這就說明了在食物經(jīng)過胃的短暫時(shí)間內(nèi)，為何幾乎只有Hp能透過不溶性粘液層，而其它細(xì)菌很難通過的重要原因。

　　第二，Hp依靠其菌體表面菌毛樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定地定居于胃粘膜上皮細(xì)胞表面，Hp透過不溶性粘液層后首先仍然通過鞭毛在粘膜上皮表面“拋錨”。然后菌體迅速向粘膜上皮表面靠攏。偽造其菌體表面菌毛樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（或稱糖萼Glycocalyx)與胃粘膜上皮細(xì)胞表面緊密相連，達(dá)到比較穩(wěn)定地固定在胃粘膜上皮的局部。這Hp特異性地只在胃粘膜組織或腸及食管胃化的組織上定居，而不在其他組織上定居的原因，可能在胃粘膜組織上存在有Hp的特異性受體之故。正由于它存在著特異性的較強(qiáng)的粘附機(jī)制，因此盡管不溶性粘液層和胃粘膜上皮以較快的速度不斷代謝更新，一部分Hp隨著表面的粘膜上皮和不溶性粘液層的更新而脫落，但總還是有一部分Hp在胃的不斷運(yùn)動(dòng)中在就近的新生的粘膜表面或不溶性粘液層找到繼續(xù)定居的場所。這就是造成人類的胃粘膜一旦被Hp感染后，Hp就較難以徹底消除的緣故，結(jié)果易形成持續(xù)感染的狀態(tài)。這也是人胃的Hp感染率為何這么高的原因。

　　第三步，Hp部分細(xì)胞壁與胃粘膜上皮細(xì)胞直接相貼，依靠其脂多糖與細(xì)胞毒素等引起胃壁的病變，Hp的感染還不等于發(fā)病，只有在某種尚待探明的因素影響下，Hp菌體的部分細(xì)胞壁與胃粘膜上皮細(xì)胞直接相貼的第三種粘附機(jī)制過渡后，才由于細(xì)胞壁（這時(shí)Hp已失去包在菌體外面的一層外膜樣結(jié)構(gòu))脂多糖的內(nèi)毒素樣作用引起局部粘膜樣結(jié)構(gòu))脂多糖的內(nèi)毒素樣作用引起局部粘膜的炎癥。另外，粘膜上皮表面大量Hp還可能由于所產(chǎn)生的強(qiáng)有力的尿素酶分解尿素后產(chǎn)生的氨離子阻擋H⁺從胃腺向胃腔通過。胃蛋白酶對粘液素的降解，細(xì)胞毒素對細(xì)胞的毒性作用等導(dǎo)致粘膜的潰瘍。胃炎可能是潰瘍的基礎(chǔ)，反過來，潰瘍又可能促進(jìn)胃炎，因此慢性胃病中的胃炎和潰瘍兩種基本類型都與Hp感染的直接或間接作用密切相關(guān)。Hp在體外對許多抗生素是敏感的，但是由于種種原因真正能用于胃部疾病治療的抗生素是有限的，即使有效的抗生素，由于不溶性粘液層的保護(hù)作用，亦很難將Hp徹底消滅干凈。

張振華

上海第二醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室（200025)