二、流式細胞計的基本結(jié)構(gòu)和工作原理
流式細胞計是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。多數(shù)流式細胞計是一種零分辨率的儀器，它只能測量一個細胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細節(jié) 分辨率為零。國外又把流式細胞計稱作熒光激活細胞分選器（Flu－orescence Activated Cell Sorter, FACS)。美國Becton—Dickinson 公司生產(chǎn)的流式細胞計系列均冠以FACS字頭。目前我國國內(nèi)使用的儀器多為美國、西歐及日本等國的產(chǎn)品，國內(nèi)有些單位也已研制成功，但尚無定型產(chǎn)品面市。
1．流式細胞計的基本結(jié)構(gòu)流式細胞計主要由四部分組成。它們是：流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。圖10-1為其結(jié)構(gòu)示意圖。
圖10-1 流式細胞計結(jié)構(gòu)示意圖
�。�1)流動室和液流系統(tǒng)：流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計和制作均很精細，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號可發(fā)生振動。
�。�2)激光源和光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線最強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以647nm較強。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。為使細胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來選擇激光的波長，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長λ。為了進一步使檢測的發(fā)射熒光更強，并提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區(qū)段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素)發(fā)射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。
�。�3)光電管和檢測系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。光電倍增管（PMT)最為常用。PMT的響應(yīng)時間短，僅為ns數(shù)量級；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié) ，因此對弱光測量十分有利。光電管運行時特別要注意穩(wěn)定性問題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因為光譜響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強光下穩(wěn)定性比PMT好。
從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號，例DNA測量等。另一類是對數(shù)放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽性三個亞群，它們的熒光強度相差1～2個數(shù)量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié) 便利、細胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點。
�。�4)計算機和分析系統(tǒng)：經(jīng)放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數(shù)是和電信號的脈沖高度相對應(yīng)的，也是和光信號的強弱相關(guān)的。對應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號的細胞相對數(shù)目。多道分析器出來的信號再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計算機的硬盤和軟盤上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的6～8個參數(shù)。存貯于計算機內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實測后脫機重現(xiàn)，進行數(shù)據(jù)處理和分析，最后給出結(jié)果。除上述四個主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。
2．流式細胞計的工作原理下面分別簡要介紹流式細胞計有關(guān)的參數(shù)測量、樣品分選及數(shù)據(jù)處理等工作原理。
�。�1)參數(shù)測量原理：流式細胞計可同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因為這些生物學(xué)參數(shù)又和細胞對光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經(jīng)染色活細胞進行分析和分選。經(jīng)過固定的和染色處理的細胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號當(dāng)然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。
在流式細胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0。角)散射（FSC)；②側(cè)向散射（SSC)，又稱90。角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經(jīng)實驗表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對于形狀復(fù)雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測量主要用來獲取有關(guān)細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關(guān)，但它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。
在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。
熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學(xué)等測量中，對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關(guān)鍵。一般說來，細胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等)的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。
減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；③采用電子補償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。
�。�2)樣品分選原理：流式細胞計的分選功能是由細胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。
穩(wěn)定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數(shù)百μm。實驗經(jīng)驗公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數(shù)十ms。精確測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來產(chǎn)生延遲�？筛鶕�(jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。
