自Gall和Pardue建立了原位雜交技術(shù)以來近20余年內(nèi)，這一技術(shù)為基因的定位和表達、基因進化、發(fā)育生物學、腫瘤學、微生物學、病毒學、醫(yī)學遺傳學和遺傳分析等領(lǐng)域研究提供了極其寶貴的資料，發(fā)揮了其它技術(shù)難以取代的作用。近年來，此一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴大并在兩個主要進行了技術(shù)法的改進。一方面是應(yīng)用一系列放大手段增強檢測的靈敏度（詳見二十二章 )，另一方面是提高其分辨率，即向電鏡水平發(fā)展。Jacob（1971)首先用3H標記的核酸RNA探針與DNA雜交并在電鏡水平顯示獲得成功，繼后不少科技工作者在這方面做了大量的工作（Manning et al 1975,Steinert et al 1976,Hutchison et al 1982)。但所應(yīng)用的均是同位素標記核酸探針，直到1986年Binder首先用生物素標記的rDNA及UI探針，在蜂蠅（Drosophila)卵巢，應(yīng)用Lowicryl-K4M低溫包埋的切片上進行原位分子雜交，以蛋白A和膠體金復合物作為顯示系統(tǒng)，較好的保存了組織的形態(tài)學結(jié)構(gòu)和較高的信噪比例。Webster等人（1986)應(yīng)用生物素標記探針顯示了細胞內(nèi)mRNA的分布。Singer等（1989)成功的用雙標記原位雜交技術(shù)，一方面檢測整裝抽提細胞內(nèi)與骨架結(jié)合的mRNA，同時顯示了該mRNA所表達的蛋白質(zhì)。新近Fischer等利用地高辛標記rRNA探針在Lowicryl-K4M包埋的切片進行雜交，然后以抗地高辛等抗體結(jié)合膠體金顆粒進行顯示，以銀顯示法加強獲得極為滿意的定位�？傊�，電鏡水平的原位分子雜交技術(shù)在國外還處在不斷提高和改進的階段，在國內(nèi)此一技術(shù)還剛起步。焦仁杰等（1992)報告了以生物素標記腺病毒的基因組探針與整裝抽提的細胞進行電鏡原位雜交技術(shù)，成功地證明了腺病毒DNA與核骨架的緊密結(jié)合關(guān)系，膠體金顆粒呈簇狀與串珠狀結(jié)合在核骨架上。向正華等（1994)應(yīng)用地高辛標記探針結(jié)合HRP的包埋前染色法顯示了POMc mRNA定位于神經(jīng)元的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。下面列舉幾種代表性的電鏡原位雜交技術(shù)。
一、應(yīng)用同位素標記cRNA探針電鏡原位雜交技術(shù)于染色體制片（Hutchison et al, 1982)
（1)將整封染色體鋪片放置于金網(wǎng)上，在70%的酒精蒸汽固定4～15h，空氣干燥。
�。�2)以強堿使DNA變性，將金網(wǎng)置于2×SSC內(nèi)（應(yīng)用0.1n NaOH調(diào)整至pH12)，室溫，2min。
（3)脫水，以70%和95%酒精各沖洗3次，空氣干燥。
�。�4)雜交，金網(wǎng)覆于平面玻璃皿（ Petri dish)內(nèi)的雜交液滴上，每滴約10～15μl，將此小碟置于盛于雜交緩沖的大塑料盒內(nèi)，保持濕潤，在60～65℃孵育4～24h。
雜交液的配制：6×SSC或6×TNS（1×TNs =0.1mol/L NaCl, 0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000～50000cpm/10μl 3h cRNA)。
（5)雜交后沖洗，金網(wǎng)自雜交液中取出后立即用大量的2×SSC沖洗多次。RNA酶溶液（20μg/ml)室溫沖洗，然后再用2×SSC室溫沖洗，沖洗后梯度酒精脫水（70%，95%)空氣干燥。
�。�6)浸入乳膠膜，應(yīng)用L-4核乳膠液，水稀釋4倍。浸膜后的金網(wǎng)，用膠帶固定在載玻片上放在密封的黑色塑料盒內(nèi)，4℃，時間根據(jù)同位素種類和靶mRNA含量而定，也可選擇不同時間曝光，根據(jù)顯影強弱確定最終顯影的時間。
（7)顯影。暗盒自冷房或冰箱中取出后，在室漸中回暖至少30min，以防核乳膠膜皺縮。然后在顯影液（Kodax Microdol X)顯影3～5min，溫度18～24℃。水沖，在15% Kodax快速定影液定影5min，然后在空氣中干燥。
所有溶液應(yīng)盡可能新鮮配制。
�。�8)電鏡觀察。
二、應(yīng)用生物素標記DNA探針電鏡原位雜交技術(shù)
�。ㄒ�)基本原理
應(yīng)用DNA探針缺口翻譯（nick translation)方法，通過堿基配對以一條DNA鏈為模板，將生物素標記的某一種脫氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP滲入有缺口的DNA鏈。將生物素標記的DNA探針與細胞或組織進行原位雜交。顯示方法有二種：一種是用HRP顯示，類似免疫電鏡技術(shù)中采取的包埋前染色法，利用地高辛-過氧化物酶HRP顯色法進行光鏡水平的厚片原位雜交免疫細胞化學染色，其步驟與第二十章 敘述的原位雜交免疫細胞化學基本方法相同，只是為了減少細胞微細結(jié)構(gòu)的損傷，在包埋過程中減少H2O2和Triton X-10等易損傷細胞與組織結(jié)構(gòu)的試劑用量（向正華等1993)。在顯色完畢后，取反應(yīng)陽性部位按常規(guī)電鏡操作程序進行鋨酸后固定，脫水，包埋，切片和觀察。此法利用HRP免疫反應(yīng)產(chǎn)物具有極高電子反應(yīng)密度體積大小不一，加之非特異性反應(yīng)產(chǎn)物常掩蓋微細結(jié)構(gòu)的背景，不易達到準確的定位�，F(xiàn)在比較廣泛應(yīng)用的是生物素-蛋白A（PA)膠體金（gold)標記技術(shù)。用于原位雜交的電鏡定位，取得較為滿意的效果。其基本原理是利用生物素標記探針與細胞或組織進行原位雜交后，利用抗生物素抗體-結(jié)合蛋白A-金標記雜交體的超微結(jié)構(gòu)定位，類似免疫電鏡中的包埋后染色。在包埋劑應(yīng)用方面，有報告應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋獲得成功的。但大多數(shù)較滿意的結(jié)果均獲自低溫親水性包埋劑——Lowicryl-K4M，也有應(yīng)用LR-white作為包埋劑的（詳見第七章 )。
