一、基本原理
鐵蛋白是一種含鐵約占23%的蛋白質(zhì)，分子量460kD,直徑10～12μm�？贵w與鐵蛋白通過低分子量的雙功能試劑結(jié)合為一種雙分子復(fù)合物。此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有致密的鐵離子核心，鐵膠粒直徑核心為55～60nm含2000～3000個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成四個圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，便于電鏡觀察。鐵蛋白來自許多動物，以肝、脾含量較高，其中馬脾臟含量最高。因而，商品鐵蛋白主要是從馬脾臟中提取的。
二、鐵蛋白的提取和純化
取健康的馬脾（新鮮或冰凍均可)，去除脾外的淋巴結(jié)和脂肪組織，按濕重1：1.5或1：2加入蒸餾水，用組織勻漿器將組織勻漿，置水浴中加熱至75～85℃，使鐵蛋白以外的蛋白質(zhì)變性，冷卻后用2～4層紗布過濾，濾液離心取上清液，每100ml上清液中加入35g硫酸銨，充分?jǐn)嚢枋硅F蛋白沉淀析出，4℃過夜，3000～10000r/min離心20min，棄去上清液，刮取沉淀物置透析袋內(nèi)，剩余沉淀物以蒸餾水洗后，一并加入透析袋內(nèi)對水透析，除去硫酸銨。100ml中加入4～5g硫酸鎘使炎結(jié)晶，在室溫或4℃冰箱內(nèi)使之出現(xiàn)鐵蛋白結(jié)晶。此鐵蛋白結(jié)晶以2%硫酸銨（pH5.58)溶解后，如上述再用硫酸鎘使之結(jié)晶。反復(fù)溶解，結(jié)晶六次，達(dá)到純化。純化后鐵蛋白在半飽和的硫酸溶液內(nèi)可保存1～2年。用時以蒸餾水透析除鹽后即可應(yīng)用，應(yīng)用前可以用負(fù)染色法在電鏡下觀察，了解鐵蛋白的完整性和純度。
商品制備的鐵蛋白是用2%硫酸銨溶液稀釋的1%～2%溶液（pH5.85)。為了在應(yīng)用中得到滿意的結(jié)果，應(yīng)用前必須將商品制備的鐵蛋白進(jìn)一步純化。純化的方法是用0.1n NaOH或0.1n HCl調(diào)整pH值至5.85，然后加入20%硫酸鎘溶液使其在鐵蛋白液中最終濃度為5%硫酸鎘，此溶液置于4℃冰箱內(nèi)2h（或過夜)至結(jié)晶完成，離心1h（2000r/min)充上清液。鐵蛋白結(jié)晶再溶解，離心除去不溶性顆粒，傾出上清液，加入5%硫酸鎘再結(jié)晶，至在顯微鏡下呈棕紅色鐵蛋白結(jié)晶為止。將結(jié)晶溶于2%硫酸銨溶液中，用50%5硫酸銨溶液沉淀三次，第三次沉淀形成的沉淀物溶于少量蒸餾水中，先對自來水透析，再對0.05mol/L,pH7.5磷酸緩沖透析12～24h。純化的鐵蛋白溶液用100000r/min 超速離心2h ，除去3/4無色上清液，沉淀物（內(nèi)含鐵蛋白)在4℃過夜，待完全融解后，用微孔濾過器（Millipore filter, 孔徑 0.25～0.45μm)過濾，保存1～2年內(nèi)仍可使用。
三、鐵蛋白與免疫球蛋白的結(jié)合
一般用低分子量的雙功能試劑把兩者聯(lián)結(jié)起來，常用的雙功能試劑有間苯二甲基二異氰酸鹽（簡寫XC)。甲苯2，4二異氰酸鹽（簡寫TC)。鄰茴香胺（簡寫B(tài)DD)；對，二氟一間，間，二硝基二苯礬（簡寫FNPS)和戊二醛。近年來，普遍認(rèn)為戊二醛作為聯(lián)結(jié)劑效果較好，對抗體活性影響小，標(biāo)記抗體產(chǎn)量高。分為一步法和二步法，現(xiàn)簡介如下：
1．一步法 以15mg 鐵蛋白和3mg球蛋白溶于0.9ml 0.1mol/L磷酸緩沖液中，pH7.0,加入0.1ml新鮮配制的戊二醛溶液，使其最終濃度為 0.005%～0.05%, 加入0.02%疊氮鈉（NaN3)防腐，此混合液置37℃24h，無需攪拌，結(jié)合完畢后加0.01mol/L賴氨酸中止反應(yīng)。
2．二步法
�。�1)在含50～80mg鐵蛋白的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.0)中，加入稀釋的戊二醛，使其最終濃度為0.05%～0.15%，總體積為1ml。
�。�2)置37℃作用2h后，經(jīng)葡聚糖G—25 濾柱，除去未結(jié)合的戊二醛。為避免不必要的稀釋，只收集脫峰的中間部分。然后加入球蛋白（鐵蛋白與球蛋白之比為5：1)即鐵蛋白最終濃度為15mg/ml，球蛋白3mg/ml。
（3)混合液置37℃，作用12h（無需攪拌)，加入0.01mol/L 的賴氨酸以中止進(jìn)一步交聯(lián)。兩步反應(yīng)都需在0.02% NaN2防腐條件下進(jìn)行。醫(yī)學(xué)全.在線.網(wǎng).站.提供
四、電鏡標(biāo)本的制備方法
1．固定 同常規(guī)電鏡一樣，應(yīng)用醛類和四氧化鋨雙固定，以維持細(xì)胞和組織的超微結(jié)構(gòu)。有文獻(xiàn)報告以4%的甲醛溶液在pH7.2的磷酸緩沖內(nèi)，在0℃進(jìn)行固定，并用四氧化鋨作后固定，不會影響抗原的反應(yīng)能力。高錳酸鉀能使大部分抗原失去活性，一般不宜采用。另外，鐵蛋白標(biāo)記抗體的特點之一是分子量大。因此，如用于細(xì)胞表面抗原的定位研究，可將樣品直接放入固定液，否則需采取適當(dāng)?shù)拇胧�，打破�?xì)胞膜，增強細(xì)胞對標(biāo)記抗體的通透性，常采取以下方法：
�。�1)凍融法：將小塊組織或細(xì)胞經(jīng)固定后，凍融一次，使細(xì)胞膜破裂，標(biāo)記抗體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
（2)冰凍切片法：固定后組織快速冷凍，切成10～15μm左右薄片，溶化的切片直接浸泡于鐵蛋白標(biāo)記抗體液中。
（3)有報道經(jīng)戊干杯固定后，浸入4×10-3mol/L洋地黃皂甙液中1～2min，能有助于增強細(xì)胞膜的穿透性，使標(biāo)記抗體液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
2．免疫反應(yīng)處理 常用包埋前染色，分直接法和間接法兩種。在染色前，將組織切成約10～20μm厚的薄片。
（1)直接法：將薄片直接浸泡于標(biāo)記抗體液中，室溫或37℃作用1～2h或更長；緩沖液（有人提倡用冷緩沖液)浸漂，除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體溶液，然后轉(zhuǎn)入常規(guī)雙固定和電鏡包埋。
（2)間接法：
�、賹⒔M織切片浸于第一抗體液中，室溫30～60min。
�、谝源罅坷渚彌_液充分?jǐn)嚢柘礈�，至�?次，每次30min。
�、劢腓F蛋白標(biāo)記抗體液中，室溫30min。
④如②，用緩沖液充分洗滌后，可以自然沉淀或用離心方法撈取組織片。
�、輰㈦x心沉淀小塊，用四氧化鋨固定30min。
⑥常規(guī)電鏡脫水、包埋、切片、染色和觀察。
