�。ǘ�)分離病毒的鑒定
1．病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征
�。�1)細(xì)胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE)病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖引起細(xì)胞退形性變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測性診斷（表23-4)。免疫熒光（IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點，細(xì)胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。
表23-4 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征
| 病毒 | 增殖指征 |
| CPE病毒
小RNA病毒 單純皰疹病毒 腺病毒 副粘病毒 HIV 非CPE病毒 正粘病毒 副粘病毒 風(fēng)疹病毒 鼻病毒 |
細(xì)胞園縮、單層破壞
細(xì)胞腫大變園 細(xì)胞變園堆積成葡萄狀 多核巨細(xì)胞（合胞體) 紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象 干擾并阻止其他病毒（如ECHO病毒)的細(xì)胞致病作用 |
（2)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（Hemadsorption phenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后24-48小時，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng)的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。
�。�3)干擾現(xiàn)象 (Interference phenomenon)一種病毒感染細(xì)胞后可以干擾另一種病毒在該細(xì)胞中的增殖，這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒（如風(fēng)疹病毒)但能干擾以后進(jìn)入的病毒（如ECHO病毒)增殖，使后者進(jìn)入宿主細(xì)胞不再生產(chǎn)CPE。
2．病毒感染性的定量測定
空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU)測定這是一種測定病毒感染性比較準(zhǔn)確的方法。將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長單層細(xì)胞的玻璃平皿或扁瓶中，當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當(dāng)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖后，每一個感染性病毒顆粒在單層細(xì)胞中產(chǎn)生一個局限性的感染細(xì)胞病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”，清楚可見。由于每個空斑由單個病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位（PFU)來表示。
�。�2)50%致死量（LD50)或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50)的測定本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時間后，觀察細(xì)胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方法計算出50%感染量或50%組織細(xì)胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。
3．病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負(fù)染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。
4．血清學(xué)鑒定用已知的診斷血清來鑒定。補(bǔ)體結(jié)合試驗可鑒定病毒科屬；中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，檢材來源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復(fù)期雙份血清作血清學(xué)試驗，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。
三、病毒核酸及抗原的直接檢出
（一)直接檢出病毒核酸
1．核酸雜交（Nucleic acid hybridization) -臨床病毒學(xué)中報速診斷方法通常是檢測標(biāo)本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點雜交(Dot hybridization)廣泛用于檢測呼吸道標(biāo)本，尿標(biāo)本中的病毒核酸。標(biāo)本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結(jié)合到膜上，在原位進(jìn)行鹼變性處理后，有放射標(biāo)記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按鹼基到補(bǔ)原則結(jié)合成雙股，經(jīng)放射自顯影，陽性結(jié)果出現(xiàn)斑點狀雜交信號。含輪狀病毒的糞便標(biāo)本經(jīng)熱變性處理，點到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標(biāo)記探針做斑點雜交，敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補(bǔ)的DNA探針做斑點雜交。
目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病人標(biāo)本中的病毒DNA，也用于檢測不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標(biāo)本中的病毒DNA。
2．多聚酶鏈反應(yīng) (Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴(kuò)增法。先將待檢標(biāo)本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個鹼基互補(bǔ)的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA鏈，經(jīng)20～40個循環(huán)，可使1個拷貝的核酸擴(kuò)增至106以上，經(jīng)瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴(kuò)增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標(biāo)本，有較大應(yīng)用前景。
