(一)HLA-A、B、C抗原的檢測
HLA-A、B、C抗原可用血清學方法鑒定,故又稱SD抗原(serologically defined antigen),常采用微量淋巴細胞毒性試驗(microlymphocytotoxicity test),又稱補體依賴細胞毒試驗(complement dependent cytotoxicity,CDC);静襟E是分離純化外周血中的淋巴細胞,加一組已知HLA抗血清,20℃60分釧后,再加家兔補體,37℃ 60分釧后加臺盼蘭染色觀察結果,如淋巴細胞染成蘭色則為陽性,表明待檢淋巴細胞表面具有與已知抗血清相應的抗原。也可用51Cr標記的細胞毒試驗。
。ǘ)HLA-DR、DQ抗原的檢測
HLA-DR、DQ抗原檢測的基本方法是采用微量淋巴細胞毒性試驗。先從待檢者外周血中分離純B細胞,陽性血清可來自經(jīng)產(chǎn)婦,但需用血小板吸收以除去抗HLA-A、B、C抗體。標準抗血清的主要有以下幾種來源。
。1)經(jīng)產(chǎn)婦血清:在多胎生產(chǎn)的婦女中,可得到抗HLA-A、B和C抗原的抗血清。因為胎兒的HLA抗原包含了父方抗原(因其中一個單倍體來自父方),在分娩時,由于胎盤損傷等原因,胎兒的父方抗原免疫了母方,從而在母體內產(chǎn)生抗HLA抗血清,這種抗血清可能具有多種特異性,但多胎后,其中免疫原性最強的一種抗原可刺激誘導得到單一特異性抗血清。
(2)計劃免疫志愿者的血清:給志愿者注射不相容的HLA淋巴細胞,受者產(chǎn)生特異性HLA同種抗體,可用于HLA-A、B、C、DR和DQ分型。
(3)單克隆抗體:至今報道的大都是經(jīng)種間免疫(鼠抗人)獲得,小鼠免疫系統(tǒng)識別人HLA抗原所產(chǎn)生的鼠抗人單抗不同于從經(jīng)產(chǎn)婦獲得的HLA抗血清,HLA抗原分子最易為鼠免疫系統(tǒng)識別的暢敘有種間送別的決定簇,
所以應用鼠雜交瘤技術獲得HLA單抗大部分都是識別種間差異的共同決定簇,所謂單態(tài)性HLA單抗。已獲得數(shù)百種HLA單抗中,僅少數(shù)為多態(tài)性HLA-A、B、C單抗。而在已獲得的多態(tài)性單抗中也集中某幾個少數(shù)的特異性抗原,要獲得多數(shù)特異HLA單抗有賴于人-人雜交瘤技術的應用。第11次IHW報道用克隆的HLA等位基因轉染小鼠L細胞,獲取特異HLA抗原專一表達相應產(chǎn)物的轉染細胞(transfactent)以篩選相應的HLA單克隆抗體,F(xiàn)已從70多個轉染細胞中獲得抗HLA多態(tài)部分的單抗約50多種,特別針對難以檢出的DP以及部分DQ抗原的單抗,這些細胞和基因工程產(chǎn)生的制劑具有精細的分辨力,有助于確定各種HLA等位基因產(chǎn)物的結構和各人群特異性抗原的檢測和分析。醫(yī)學全.在線.網(wǎng).站.提供
。ㄈ)HLA-D抗原的檢測
以往HLA-D抗原用混合淋巴細胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture)來鑒定,故又稱LD抗原(lymphocyte defined antigen),有雙向MLC和單向MLC兩種分型法。
1.雙向MLC 供者和受者淋巴細胞在體外共同孵育時,由于Lads抗原不同而相互刺激轉化為母細胞。供者和受者組織相容性愈差,相互刺激也愈強,轉化率就愈高。雙向MLC缺點是操作方法復雜,穩(wěn)定性與重復性差,一般要5-7天,對尸體供腎者多無法預先測定。
2.單向MLC 屬于陰性分型法,基本步聚是將已知HLA-D抗原的淋巴細胞用絲裂霉素C(mitomycin C)或X線照射處理,成為只有抗原激發(fā)能力而無增殖反應能力的“刺激細胞”。將刺激細胞與末經(jīng)過這種處理的待測淋巴細胞進行混合培養(yǎng),根據(jù)待測細胞出現(xiàn)母細胞反應的程度,則可知待測淋巴細胞上是否具有與“刺激細胞”上相同的HLA-D抗原。在MLC起激發(fā)抗原的主要是B細胞和單核細胞上的D抗原,反應細胞為CD4陽性T細胞。本法特點同雙向MLC。在單向MLC中作為刺激細胞最好用純合子配型細胞(homozygous typing cell,HTC),因為純合子是兩個單體型完全相同,因此只有一種D抗原。
純合子分型細胞的來源:
。1)姨姑表婚配的子女約占1/16的機率找到純合子細胞。
(2)多發(fā)性硬皮病患者中表現(xiàn)為HLA-D2和HLA-B7連鎖不平衡的個體具有異常高的純合子頻率。
。3)風濕性關節(jié)炎患者D位點純合的發(fā)生率也較高。
圖6-12 姑姨表婚配的HLA單體型的遺傳模式圖