VentTM DNA多聚酶：是美國(guó)New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔（Vent)中分離的超級(jí)嗜熱菌-能生長(zhǎng)于98℃中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的，故名Vent酶。它的一些酶學(xué)性質(zhì)較Taq DNA聚合酶更為優(yōu)越，它能耐100℃高溫且2h以上仍有活力，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力，錯(cuò)誤擴(kuò)增的機(jī)率比Taq酶降低一倍。后來該公司又從深水潛艇（2010m)排氣孔分離的能在104℃生長(zhǎng)的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表達(dá)的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半壽期達(dá)23h（Vent酶為6.7h,Taq酶為1h)。
4．RTth逆轉(zhuǎn)錄酶（rTth Reverse Transcriptase)目前逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR)的發(fā)展很快，所以對(duì)耐熱的依賴于RNA的DNA多聚酶的研究也有進(jìn)展。有實(shí)驗(yàn)表明Taq DNA多聚酶有依賴于RNA的DNA聚合酶活性，但活性較弱。Cetus公司于1991年推出一種rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依賴于RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴于DNA的耐熱DNA聚合酶活性，二種活性分別依賴于Mn2+Mg2+，這樣就可分別控制酶活性。利用該酶只需250ng的總RNA即可有效地進(jìn)行RT-PCR，得到特異的DNA片段，從而非常有利于逆轉(zhuǎn)錄PCR的發(fā)展。
耐熱DNA聚合酶的研究近幾年來得到長(zhǎng)足的發(fā)展，這在PCR發(fā)展中起到了重要的作用。我們相信隨著進(jìn)一步的研究，將使人們對(duì)耐熱DNA聚合酶的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用更進(jìn)一步地發(fā)展。
我國(guó)的PCR研究發(fā)展很快，其關(guān)鍵試劑-耐熱DNA聚合酶-也已有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室能夠分離純化，如復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所、華美公司、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。后二者的菌株為Thermus aquaticus YT-1。前者則是從自己篩選的嗜熱菌中分離純化，復(fù)旦大學(xué)遺傳所亦已成功地克隆了該聚合酶的基因并獲得了耐熱F4DNA聚合酶，其酶學(xué)性質(zhì)非常接近于Taq DNA聚合酶，為我國(guó)PCR的開展提供了保證。
四、影響PCR特異性的因素
通過上述內(nèi)容�？梢钥闯鲇性S多因素可以影響PCR的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時(shí)間及延伸時(shí)間可以減少錯(cuò)誤引發(fā)及錯(cuò)誤延伸。③引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。④改變MgCl2(有時(shí)KCl)濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對(duì)Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次級(jí)結(jié)構(gòu)，例如待擴(kuò)增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2’-脫氧鳥苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate)(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP)代替200μmol/l dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。醫(yī)學(xué).全在線www.med126.com
五、擴(kuò)增平坡
擴(kuò)增反應(yīng)并不是可以無窮地進(jìn)行下去的，經(jīng)過一定的循環(huán)周期后需擴(kuò)增的片段不再按指數(shù)增多而逐漸進(jìn)入平坡；進(jìn)入平坡的循環(huán)次數(shù)，取決于起始時(shí)存在的模板拷貝數(shù)以及合成的DNA總量。所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物達(dá)0.3～1pmol時(shí)，由于產(chǎn)物的堆積，使原來以指數(shù)增加的速率變成平坦的曲線。
造成PCR進(jìn)入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完畢、Taq酶失活，這幾中因素在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中均不會(huì)出現(xiàn)。此外，還有幾種可能：
1．底物過剩 因DNA合成量多于反應(yīng)液中存在的Taq酶，在100μl反應(yīng)液中含2.5Utaq酶而DNA合成量達(dá)1μg（3nmol脫氧核苷酸)時(shí)，開始變?yōu)榈孜镞^剩。延長(zhǎng)延伸時(shí)間或添加Taq酶，可以克服之。但不實(shí)用，因每進(jìn)行下一循環(huán)就要延長(zhǎng)延伸時(shí)間一倍及多加一倍Taq酶，才能繼續(xù)保持指數(shù)增長(zhǎng)。
2．非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng) 與上述情況密切相關(guān)，此時(shí)不需要的DNA片段與需要的片段同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)聚合酶，要克服這一情況是要提高反應(yīng)特異性，使不需要片段不能大量積聚。
3．退火時(shí)產(chǎn)物的單鏈自己締合 兩條單鏈的DNA片段在退火時(shí)除了與引物締合外，也可以自行締合，這也會(huì)阻止產(chǎn)品增多。當(dāng)產(chǎn)物濃度到達(dá)10pmol/100μl時(shí)即可發(fā)生此現(xiàn)象，除稀釋外無法克服。
4．變性在高濃度產(chǎn)物條件下，產(chǎn)物解鏈不完全，以及最終產(chǎn)物的阻化作用（焦磷酸化，雙鏈DNA)。
總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴(kuò)增，然后稍稍改變各參數(shù)，可以達(dá)到優(yōu)化，以取得優(yōu)良的特異性和產(chǎn)率。
