影響PCR的主要因素

　　三、DNA聚合酶

　　早在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ純品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個(gè)片段，一個(gè)片段分子量為76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment)。另一個(gè)片段分子量為34000，具有5’→’3’外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個(gè)加到3-OH末端。二是有’3’→5’外切酶活力，能識(shí)別和消除錯(cuò)配的引物末端，與復(fù)制過(guò)程中校正功能有關(guān)。三是5’→3’外切酶活力，它能從5’端水解核苷酸，還能經(jīng)過(guò)幾個(gè)核苷酸起作用，切除錯(cuò)配的核苷酸。1985年Mullis 等發(fā)明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR后，世界上許多實(shí)驗(yàn)室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進(jìn)行PCR，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發(fā)展。人們從生活于60℃（B.Stearothermophilus)到87℃（S.Solfatavicus)的許多菌中分離純化出耐熱DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA變性所需溫度，所以無(wú)法應(yīng)用于PCR。現(xiàn)就PCR反應(yīng)中常用的DNA聚合酶等作一詳細(xì)介紹。

　　1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及應(yīng)用的關(guān)鍵。Klenow片段不能耐受95℃的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環(huán)都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高溫，避免了不斷補(bǔ)加多聚酶的繁瑣操作，同時(shí)使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR的干擾，增進(jìn)了PCR特異性、產(chǎn)量和敏感度，二者相比，其主要區(qū)別在于：①Klenow酶的最適溫度為37℃，擴(kuò)增的產(chǎn)物并非全是目的序列，需用探針檢測(cè)。Taq酶則不僅產(chǎn)率高而特異性也高。它的最適溫度為74～75℃。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴(yán)格性提高，減少錯(cuò)配引物的延伸。②循環(huán)后期酶量漸感不足而產(chǎn)生平坡。到達(dá)平玻的循環(huán)次數(shù)，Klenow酶為20個(gè)（均用1μg基因組DNA開(kāi)始)而Taq酶為30個(gè)。③延伸片段長(zhǎng)度Taq酶為10kb以內(nèi)，而Klenow酶為400bp以內(nèi)。

　　Taq酶由水棲高溫菌（Thermus aquatics)YT1蓖株中分離而得。此菌于1969年由Brock分離自美國(guó)黃石公園溫泉，作為棲熱桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其生長(zhǎng)溫度為70～75℃。最初從中分離到分子量60～68KDa，比活性為2000～8000U/mg的DNA聚合酶。后來(lái)Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬(wàn)U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為75～80℃，與單純核苷酸的結(jié)合率（Kcat)可達(dá)150核苷酸（nt)/s酶分子。以M₁₃模板，用富含G+C的30bp引物延伸，70℃時(shí)Kact>60nt/s；55℃可達(dá)24nt/s；37℃時(shí)為1.5nt/s，而22℃時(shí)低至0.25nt/s。高于90℃時(shí)DNA合成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結(jié)合。

　　在PCR反應(yīng)混合液中，Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的時(shí)間分別為130、40及5～6min，在50次循環(huán)的PCR中當(dāng)管內(nèi)最高溫度為95℃。每循環(huán)為20s時(shí)尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半壽期為40min，故在PCR循環(huán)中選用的變性溫度，不宜高于95℃。

　　Taq酶現(xiàn)已可用基因重組的方法生產(chǎn)，商品名為Ampli Taq（Cetus公司)。Taq酶的完整基因長(zhǎng)2499bp，在大腸桿菌中表達(dá)生產(chǎn)，含832個(gè)氨基酸。在氨基酸序列上與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括對(duì)dNTP結(jié)合，引物與模板作用區(qū)均存在于Taq酶中。

　　Taq酶具有依賴DNA合成的5’→’3’外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻斷物”，會(huì)被逐個(gè)切除而不會(huì)阻止來(lái)自上游引物鏈的延伸，而對(duì)于5’-³²P標(biāo)記的合成寡核苷酸引物，則無(wú)論是單鏈或是與模板復(fù)性，都未發(fā)現(xiàn)降解，所以該種活性不會(huì)影響PCR結(jié)果。Taq酶沒(méi)有3’→’5’外切酶活性，如果發(fā)生dNTP錯(cuò)誤摻入，這種酶沒(méi)有校正能力，因此運(yùn)用Taq酶進(jìn)行PCR，產(chǎn)物中點(diǎn)突變較多，對(duì)克隆等不太有利。一般錯(cuò)摻率為1.25×10^-4~1×10^-5(4×dNTPs濃度分別為200μmol/L，Mg²⁺為1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3’→5’外切酶活性對(duì)測(cè)序有利。

　　2．影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg²⁺離子的影響。用鯡精DNA為模板，總dNTP濃度0.7～0.8mmol/L,Mg²⁺為2.0mmol/L時(shí)激活能力最高。濃度超過(guò)此值產(chǎn)生抑制。10mmol/l MgCl₂抑制活力達(dá)40%～50%。dNTP能與Mg²⁺結(jié)合，故游離Mg²⁺只是結(jié)合后剩余的量。若總dNTP濃度高至4～6mmol/L時(shí),Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

　　dNTP濃度低時(shí)PCR產(chǎn)率及特異性均增高，適合于用擴(kuò)增摻入法標(biāo)記生物素及放射性元素。當(dāng)100μl　PCR液中含dNTP各40μmol/L時(shí)就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半)。

表22-3 有機(jī)溶劑對(duì)Taq聚合酶活力的影響

　　用鯡精DNA，70℃，10min內(nèi)dNTP的摻入量計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)條件為100%。

　　純9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力。誤摻入率取決于dNTP濃度。但Taq酶具有DNA依賴的鏈移位5’→3’核酸外切酶活力。對(duì)5’→3’³²P標(biāo)記寡核苷酸單鏈，或與MB模板雜交時(shí)均只有極少的降解力。

　　中等濃度KCl能刺激Taq酶合成活力達(dá)50%～60%，最佳KCl濃度為50mmol/L，濃度更高有抑制作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。

　　加入50mmol/L NH₄Cl或NH₄Ac或NaCl,可產(chǎn)生中度抑制或無(wú)作用。

　　低濃度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影響不大，吐溫20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%)的抑制作用。

　　3．第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel將Taq DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289個(gè)氨基酸)去除，稱為stoffel片段。其97.5℃的半衰期從Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同時(shí)該酶片段也對(duì)兩個(gè)或更多模板位點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)即復(fù)合PCR（Multiplex PCR)更為有利。

上一頁(yè)  [1] [2] [3] [4] 下一頁(yè)