一、兼并引物（Degenerate Primer)PCR
密碼子具有兼并性，如表22-4，單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不精確的，但可以設(shè)計成對兼并引物，擴增所有編碼已知順序的核酸序列。用兼并引物時寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數(shù)量應(yīng)相同。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強，設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，針對兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴增、克隆和序列分析�，F(xiàn)已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因、糖尿病相關(guān)肽基因和哺乳動物與禽類的嗜肝病毒基因。用脫氧肌苷（deoxyinosine；DI)引物進行PCR，可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基，DI的特異性主要受cDNA濃度影響。
表22-4 密碼兼并性
| 氨基酸 | 密碼子數(shù) |
| M、W | 1 |
| C、D、E、F、H、K、N、Q、Y | 2 |
| I | 3 |
| A、G、P、T、V | 4 |
| L、R、S | 6 |
注：選擇使用的肽鏈最好避開有4～6個密碼子的氨基酸
二、套式引物（Nested Primer)PCR
用第一套引物擴增15～30個循環(huán)，再用擴增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴增15～30個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到高效擴增，而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子濾過器離心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用來分析中國倉鼠卵巢細胞AS52的分子突變。AS52細胞含有單拷貝的細胞gpt（guanine phos－phribosy transferase)基因，與哺乳動物具有同源性。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。對環(huán)境樣品中微生物檢測和單拷貝的基因靶DNA的擴增是非常有效的。
若將套式PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度（至25～30bp)，同進縮短內(nèi)引物長度（15～17bp)，使外引物先在高溫退火溫度下做雙溫循環(huán)擴增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴增的基礎(chǔ)上作低溫火溫度的三溫循環(huán)直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入，兩種循環(huán)一氣呵成，等于只做一次PCR，而靈敏度與套式二次PCR無異，在我們最近推出的PTc 51氣流式DNA熱循環(huán)儀上就可以完成全部程序。
套式一次PCR的成功，使PCR檢測的全過程可以在5h內(nèi)完成，使當(dāng)天出檢驗報告成為現(xiàn)實，也使PCR檢測走入臨床有了現(xiàn)實的基礎(chǔ)。
三、復(fù)合PCR（Multiplex PCR)
用多對引物同時擴增幾條DNA片段的方法稱為復(fù)合PCR。這一方法最初是由Chanberlain 等檢測人的基因發(fā)展而來。Bej等隨之發(fā)展了對環(huán)境樣品中不同屬細菌相關(guān)基因序列同時PCR擴增的檢測方法。兩種不同的軍團菌（legionella)基因，一為特異嗜肺L基因（mip)，另一種為L-5SrRNA基因，通過引物搖擺（staggered)添加進行復(fù)合PCR。首先mip引物PCR擴增7個循環(huán)，然后加入5SrRNA引物PCR擴增38個循環(huán)。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進行PCR擴增可以檢測大腸桿菌和與人類糞便污染有關(guān)的細菌包括E.coli大腸菌、腸源致病沙門氏菌和志賀氏菌。醫(yī)學(xué)全在.線提供
在復(fù)合PCR中，所有引物Ta值應(yīng)相近。如果兩對引物Tq值差異超過±℃10%，會使擴增產(chǎn)物的量明顯不同，其中一種擴增產(chǎn)物或目的DNA很難觀察到。另外，靶DNA的長度也應(yīng)相近，差別大時短片的靶DNA會優(yōu)先擴增，因此，會產(chǎn)生不同產(chǎn)量的擴增產(chǎn)物，為此，須采用DNA搖擺擴增或加入不等量的引物方法進行解決。
四、反向PCR（Inverse PCR或Reverse PCR)
反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA（見圖22-2)。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC)大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。
該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。
利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點分析等研究。
圖22-2 反向PCR原理示意圖
波浪線代表靶DNA，方塊代表測翼序列，▲和△代表限制酶切位
點，寡核苷酸引物與模板互補處標有平箭頭
