一、免疫金染色
（一)免疫金法（IGS)
1987年，Geoghegan等首次應(yīng)用免疫金探針檢測(cè)B淋巴細(xì)胞表面抗原，建立了用于光鏡水平的免疫金法（Immunogold staining, IGS)。IGS的特點(diǎn)是染色程序簡(jiǎn)便，不要顯色，就能檢測(cè)細(xì)胞表面的抗原，又能檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原。染色時(shí)免疫金法一般要求金顆粒的直徑大于20nm，并且用的濃度較高。用IGS定位細(xì)胞抗原時(shí)一般都采用間接法，下面以人肝組織HBsAg的定位為例說明IGS的步驟：
（1)石蠟切片→脫蠟至水。
�。�2)0.1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
�。�3)用雙蒸水振洗5＇×2。
�。�4)用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
�。�5)1%卵蛋白（EA)封閉10min。
�。�6)稀釋鼠抗HBsAg單克隆抗體（用0.02mol/l TBS pH8.2 作1：100稀釋)，4℃過夜。
�。�7)0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（8)1%EA封閉10min。
�。�9)0.02mol/l TBS pH8.2 稀釋兔抗鼠金標(biāo)抗體（1：8)37℃45min。
�。�10)0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
�。�11)雙蒸水振洗5＇×2。
�。�12)1%戊二醛，10min。
�。�13)雙蒸水5min 。
結(jié)果：在光鏡下可見部分肝細(xì)胞漿內(nèi)有金顆粒聚集呈紅色，沿細(xì)胞膜分布，表明有HBsAg定位在細(xì)胞漿內(nèi)。
（二)蛋白A-金（PAG)放大法
為了得到更明確的染色結(jié)果，在用IGS方法定位細(xì)胞抗原時(shí)可采用搭橋法，使IGS得到放大，這里介紹一種用抗A蛋白抗體作橋的PAG放大法。下面以5-羥色胺定位為例說明這一新方法。
�。�1)石蠟切片→脫蠟至水。
�。�2)1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
（3)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。
（4)1%EA封閉組織10min。
�。�5)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀釋兔抗5-羥色胺抗體（1：1000)4℃過夜，或者37℃1h。
�。�6)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。
�。�7)1%EA封閉10min。
�。�8)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀釋PAG（1：40)，37℃1h。
�。�9)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
�。�10)1%EA封閉10min。
�。�11)抗A蛋白抗體（1：100)37℃。45min。
�。�12)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（13)加0.05mol/l pH7.4 TBS稀釋PAG（1：40)，37℃45min。
�。�14)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
�。�15)雙蒸水振洗5min。
（16)1%戊二醛10min。
（17)雙蒸水振洗5min。
�。�18)0.01%伊文思藍(lán)2min，甘油封片。
光鏡下觀察，小腸粘膜內(nèi)含有嗜銀顆粒的細(xì)胞胞漿呈紅色，陽性顆粒位于細(xì)胞核底部，比單純用PAG染色深度得到加深，陽性結(jié)果得到放大。由于抗A蛋白抗體既能通過Fab段又能夠通過Fc段與PAG上的A蛋白結(jié)合，因此，與其它橋抗體相比它能夠在抗原位點(diǎn)處聚集更多的膠體金顆粒�；驹砣缦聢D5-3。
圖5-3 PAG放大法原理
PAG放大法的優(yōu)點(diǎn)：①使用試劑單一；②可大大提高IGS的敏感性，從而使應(yīng)用IGS方法定位抗原時(shí)使用高稀釋度的抗體成為可能；③背景干凈�？梢灶A(yù)見這一新方法將很快受到人們的關(guān)注。
