一、核酸分子雜交技術(shù)
1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，核酸自動合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現(xiàn)。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上（常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等)，另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交有菌落原位雜交（colony in situ hybridization)、斑點雜交法（Dot blot)、Southern印跡雜交（Southern blot)、Northern印跡雜交（Northern blot)和組織原位雜交（Tissue in situ hybridization)，即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等（詳見第十八章 )。
二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展
原位雜交組織（或細(xì)胞)化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（In situ hybridization)，如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，然后進(jìn)行雜交。Southern印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細(xì)胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。1969年美國耶魯大學(xué)Gall 和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時，Buongiorno – Nardelli和Amaldi,John及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth（1970)應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com
由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交。Bauman（1981)等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer（1982)報道用2，4二硝基苯甲醛（DNP)標(biāo)記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。
Pezzella（1987)創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來做細(xì)胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對雜交結(jié)合的探針進(jìn)行定位。本法的優(yōu)點是磺基化DAN探針標(biāo)記簡便，不需作缺口平移標(biāo)記，敏感度也較高。但自生物素和高辛標(biāo)記探針技術(shù)建立后，已有取而代之的趨勢。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat（1983)首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。這種生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)，該技術(shù)是用光敏生物素（Photobiotin)標(biāo)記核酸。目前應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補(bǔ)骨脂素生物素，它們都是由三個部分組成：光敏基團(tuán)、連結(jié)臂和生物素（圖20-1)。在強(qiáng)光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團(tuán)即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100～150個堿基才能標(biāo)記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度（Forster et al 1985)。
圖20-1 光敏生物素結(jié)構(gòu)圖
近年來，地高辛（Digoxigonin)標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場。和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時間。同時在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標(biāo)記法顯示的顏色為紫藍(lán)色（標(biāo)記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng))，有較好的反差背景。
核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA（Single stranded, ssDNA)和雙鏈DNA（Double stranded, dsDNA)之分（詳見十九章 )。早期應(yīng)用的主要是DNA探針，繼之Temin在70年代研究致癌RNA病毒時制備了cDNA探針（complementary DNA)，其基本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase)又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。CDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。RNA探針是將特異性的cDNA片段插入含有相當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動子在多克隆位點的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動子的多克隆位點的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Sense probe)和與mRNA互補(bǔ)的反義RNA探針（antisense probe)，又稱互補(bǔ)RNA探針（complementary RNA probe , cRNA)。通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。有報告認(rèn)為其雜交率高于DNA探針的8倍。
DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優(yōu)點，也可進(jìn)行放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不如克隆性探針強(qiáng)，亦不如其雜交信號高。
原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在近20年的發(fā)展可以說是飛躍的，其突出的特點是由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加，探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了，更重要的是非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在不久的將來將和現(xiàn)今的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一樣成為實驗室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。Coulton（1991)建議將非放射性標(biāo)記技術(shù)更名為親合復(fù)合物標(biāo)記技術(shù)（Affinity – Complex Labelled Probes, ACLP )。因為“非（non)“在英文里是一個否定的名詞，而且根據(jù)非放射性標(biāo)記技術(shù)的原理是將一個標(biāo)記物利用其親合性，應(yīng)用直接或間接的方法結(jié)合在核苷酸分子上。
原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項革命性的技術(shù)。它使它們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。為各個學(xué)科的研究帶來突破性的進(jìn)展。其中特別突出的是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。我們在下節(jié) 將詳加敘述。
三、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法
如前所述，由于核酸探針的種類和標(biāo)記物的不同，在具體應(yīng)用的技術(shù)方法上也各有差異，但其基本方法和應(yīng)用原則大致相同。大致可分為：①雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visual－ization)：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。
�。ㄒ�)固定
原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH)在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛)不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定劑也能獲得較滿意的效果。對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點，如沉淀性（Precipitating)固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認(rèn)為ISHH較為理想的固定劑。
