一、非特異性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機(jī)理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分為以下幾點(diǎn)：
�。�1)一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2)抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。
�。�3)除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原)，可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。
�。�4)從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
（5)抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。
�。�6)熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?/P>
二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒�，常用的方法有以下幾種：
（一)動(dòng)物臟器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠)，其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動(dòng)2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min)30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應(yīng)在臨用前進(jìn)行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應(yīng)作吸收前后之比較，吸收時(shí)可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min)30min，除去上清液，再加入熒光抗體進(jìn)行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細(xì)胞吸收是一種非特異性的消除方法，對(duì)熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時(shí)，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。
用臟器肝粉吸收對(duì)熒光抗體損失較多，如果根據(jù)Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能完全達(dá)到目的，京極方久氏認(rèn)為這樣吸收對(duì)熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時(shí)有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
�。�1)將若干只小白鼠或大白鼠放血?dú)⑺溃〕龈闻K，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結(jié)締組織的脂肪。
�。�2)剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無(wú)血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機(jī)或勻漿器作成勻漿。
�。�3)將肝勻漿裝入離心管內(nèi)（1/3左右)，交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各三次，至上清無(wú)血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15min后，再除去上清液。
�。�4)最后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜)。
�。�5)在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。
�。ǘ�)透析法
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。
�。�1)將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。
�。�2)浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（懸于大于標(biāo)記物體積約50～100倍的PBS內(nèi))，在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無(wú)熒即可（在熒光光源照射下)。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
�。ㄈ�)葡聚糖凝膠G-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細(xì)方法參閱第二章 。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣)，使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時(shí)，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進(jìn)入細(xì)篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來(lái)越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分收集，測(cè)F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測(cè)定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng))，繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來(lái)，至洗脫液中無(wú)蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未完全洗脫時(shí)即出現(xiàn)NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時(shí)，即進(jìn)行收集，之后出現(xiàn)SO4++（用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀)。最后是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀)，待洗脫液無(wú)SO4++及NH4+后可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
