�。�4)將硅化玻璃球高壓消毒，沖洗和平衡后將懸浮液過柱，得到的細(xì)胞液直接計(jì)數(shù)。也可以用淋巴細(xì)胞分離液提取，用臺(tái)盼藍(lán)測定其活性，并加10%FCS-RPMI細(xì)胞培養(yǎng)液，淋巴細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)5×106/ml。
�。�5)試管內(nèi)加0.1ml細(xì)胞液后加OKT系列單抗0.1ml，同時(shí)用另一試管加0.1mlPBS作對(duì)照�；旌弦涸�4℃放置30～60min（也可以在冰箱過夜)后，PBS（含RPMI)沖洗3次，離心后細(xì)胞沉淀物再加PBS至0.1ml。
�。�6)加0.1mlFITC標(biāo)記的抗鼠IgG（根據(jù)工作效價(jià))，4℃放置20～30min，PBS洗3次，離心后加在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，熒光顯微鏡觀察。
�。�7)陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜上有綠色熒光，有的呈顆粒樣，隨細(xì)胞滾動(dòng)。熒光鏡下可計(jì)算200個(gè)淋巴細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分率，或根據(jù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中陽性細(xì)胞算出細(xì)胞總數(shù)及百分率。
三、臨床意義
1．IEL在胃腸道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空腸100個(gè)上皮細(xì)胞有20個(gè)IEL，回腸有13個(gè)，結(jié)腸只有5個(gè)，這也可能是惡性腫瘤不發(fā)生在小腸的重要因素之一。我們發(fā)現(xiàn)胃粘膜也有IEL。在胃部炎癥和潰瘍時(shí)，上皮及腺體隱窩細(xì)胞間的IEL明顯增加。IEL不但參與免疫反應(yīng)，而且通過偽足與上皮細(xì)胞接觸，加速上皮細(xì)胞再生。電鏡下胃粘膜也發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。IEL與乳糜瀉（coeliac disease, CD)關(guān)系最密切。近期研究表明，第12型腺病毒與麥膠蛋白有同源性。CD病人腸道感染這種病毒后，服用麥膠數(shù)小時(shí)粘膜中IEL顯著增加。在上皮細(xì)胞HLAII抗原糖蛋白分子作用下與TCR結(jié)合，激活TCRαβlEL，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致腸粘膜萎縮，引起脂肪吸收不良和腹瀉等一系列臨床癥狀。增加的TCRγδIEL調(diào)節(jié) TCRαβ的殺傷作用。停服含麥膠食物后，TCRαβIEL明顯減少，上皮細(xì)胞再生恢復(fù)，臨床癥狀消失。CD病人出現(xiàn)疣狀胃炎也是IEL參與的免疫反應(yīng)結(jié)果。CD病人的腸道淋巴瘤也是來自IEL增殖。器官移植后的宿主排異反應(yīng)、結(jié)腸炎、熱帶性腹瀉、牛奶過敏和某些自身免疫性疾病均有IEL增加。也有人發(fā)現(xiàn)克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸IEL細(xì)胞毒性作用明顯減弱。當(dāng)然，IEL增加是繼發(fā)或是原發(fā)，是否IEL是這些疾病的病因，臨床治療和診斷價(jià)值如何，還不清楚。而且IEL受年齡、抗原、免疫調(diào)節(jié) 劑（考的松對(duì)IEL無影響，環(huán)磷酰胺顯著降低IEL數(shù)量)等因素影響，因此需要深入進(jìn)行研究。
2．粘膜固有層T淋巴細(xì)胞在局部體液免疫中起重要調(diào)節(jié) 作用在GALT中有開關(guān)性T淋巴細(xì)胞使生發(fā)中心的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化成IgA產(chǎn)生細(xì)胞。這些細(xì)胞減少或功能缺乏可導(dǎo)致免疫球蛋白A缺乏。有人分離出克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎病人固有層T淋巴細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)輔助性T淋巴細(xì)胞減少，抑制性T淋巴細(xì)胞顯著增加，可能導(dǎo)致局部免疫失調(diào)，引起細(xì)胞毒性或遲發(fā)性過敏反應(yīng)等，致使炎癥和潰瘍發(fā)生。
3．胃腸道腫瘤細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞研究倍受重視我們及國內(nèi)外一些報(bào)道均證明胃癌組織中T淋巴細(xì)胞顯著增加，且其細(xì)胞毒性大于非癌組織。胃癌病人周圍血T淋巴細(xì)胞毒性低于粘膜T淋巴細(xì)胞。但有人發(fā)現(xiàn)胃癌組織中T淋巴細(xì)胞的ADCC作用較弱。提示粘膜T淋巴細(xì)胞可能直接通過細(xì)胞毒作用或通過釋放淋巴因子對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用。近年來有人將癌組織中提取和分離出具有細(xì)胞毒作用T淋巴細(xì)胞，體外加入IL-2，促其增殖，再注入病人體內(nèi)進(jìn)行治療，取得明顯療效。
4．上皮細(xì)胞的MHC表達(dá)也與臨床疾病密切相關(guān)有人發(fā)現(xiàn)克隆病、潰瘍性結(jié)腸炎、放射性和感染性結(jié)腸炎和結(jié)節(jié) 病性腸炎患者小腸和結(jié)腸HLA-DR明顯增加，而且不成熟的腺體隱窩細(xì)胞也有表達(dá)。CD急性期和復(fù)發(fā)時(shí)HLA-DR表達(dá)明顯增加，緩解期明顯減少或恢復(fù)正常，說明MHC的固有性和變易性所導(dǎo)致的免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，在消化道疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要調(diào)節(jié)作用。
