原位雜交組化（ISHH)與免疫組織化學（IHC)結合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或兩個相鄰切片進行染色，這樣就可以同一細胞中顯示出某種mRNA和相應的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因的轉錄和蛋白、多肽合成的動力學。ISHH與IHC結合法可以在相鄰切片上分別進行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上進行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都獲得理想的結果，易成功，但易產生空間誤差和樣本誤差。在同一切片上進行結合法可克服這些誤差，但第一次染色總要或多或少地影響第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色過程中污染有少量RNase的液體所降解，因而在實踐中往往首先進行原位雜交組化染色，這種次序使結合法易成功。但在操作方法中應注意減少生物活性肽或蛋白的丟失，如在雜交后沖洗中適當減低漂洗溫度。
一、同位素原位雜交組化與免疫組化PAP法的聯(lián)合程序
�。�1)切片入PBS沖洗5min，最好是將切片漂洗于滅菌器皿中。
（2)0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。
（3)0.4%Triton X-100 PBS 15min。
�。�4)1μg/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。
（5)4%多聚甲醛PBS固定5min 。
（6)PBS沖洗2×3min。
（7)0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配)10min。
�。�8)2×SSC沖洗10min。
�。�9)雜交：如是cDNA探針用前需進行變性處理，載片法時將切片在空氣中晾干，加含探針的雜交液10μl于切片上，蓋上22×22mm的硅化蓋片或相當大小看蠟膜，3H標記探針每10μl雜交液含1×105cpm探針，32P或35S標記探針每10μl雜交液含5×105cpm探針；如是漂浮切片，則用滅菌吸水紙將切片水份盡量吸干，然后入雜交液，探針濃度和載片法一樣。入雜交液后43℃保溫12～16h。
�。�10)4×SSc 37℃沖洗10～30min。
�。�11)2×SSC（如為RNA探針則含20μg/ml RNase)37℃沖洗30min。
�。�12)1×SSC和0.1×SSc 37℃分別沖洗30min。
�。�13)PBS沖洗2×5min。（轉錄ISHH)
�。�14)0.5%H2O2 PBS室溫30min。
�。�15)1%BSA 37℃，30min 。
�。�16)第一抗體，4℃孵育16～24h。
（17)PBS沖洗4×5min。
�。�18)第二抗體37℃，1h。
�。�19)PBS沖洗3×5min。
�。�20)兔PAp 37℃，1h 。
（21)PBS沖洗3×5min。
（22)DAB顯色液5～10min（DAB顯色液：0.05%DAB + 0.03% H2O2 PBS液配)。
�。�23)PBS沖洗3×5min。如是漂浮切片則將其貼于涂有粘附劑的載片上，晾干。
�。�24)切片入70%，85%，95%和2個100%酒精脫水，空氣干燥。
（25)在暗室涂布乳膠（乳膠配制：乳膠原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1)，晾干，裝入自顯影暗盒。
�。�26)4℃曝光：3H標記探針4～8周，35S標記探針1～4周，32P標記探針7～10天。
�。�27)D196顯影液，20℃顯影5～10min。
�。�28)自來水沖洗數(shù)秒。
（29)F5堅膜定影液10min。醫(yī)學全在線www.med126.com
（30)自來水沖洗15min。
�。�31)切片溫箱烤干，脫水，透明，封片。
結果：蛋白或多肽免疫反應陽性細胞為棕色胞質，而其相應mRNA為黑色銀顆粒聚集。
二、非同位素原位雜交組化與免疫組化聯(lián)合法
非同位素標記物很多例如：生物素（biotin)，地高辛（Digoxigenin)，汞（mercury)，溴（bromine)和堿性磷酸酶等，其中目前應用最多的是生物素和地高辛。將此法與免疫組化PAP法或ABC法聯(lián)合使用，能成功地顯示一些神經肽mRNA和神經肽的共存與共同分布。向正華等發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶抗地高辛抗體是經木瓜蛋白酶處理的，只有抗體的Fab段沒有Fc段，而免疫細胞化學（Immunocytochemistry,ICC)所應用的抗體既有Fab段，又有Fc段。由于抗體的這一特性可在ISHH和ICC抗體孵育時將檢測核酸的抗地高辛抗體Fab段與檢測蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，這樣可明顯縮短ISHH和ICC結合法的實驗周期，同時還可以減少實驗過程中對ICC檢測的蛋白、多肽的損害，使結合法易成功。為什么兩種抗體可同時混合孵育切片，這是因為抗地高辛抗體只有Fab段，而沒有Fc段。我們知道抗體的抗原決定簇在Fc段，因此第二抗體與第一抗體的結合是第二抗體的Fab與第一抗體的Fc，所以第一抗體如果只有Fab段沒有Fc段，那么第二抗體就無法與一抗結合。因此實驗中將二種抗體混合孵育切片而不會產生交叉結合。以下為此法的原理圖（圖20-5)。
圖20-5 原位雜交細胞化學與免疫細胞化學結合法
