一、DNA探針的應(yīng)用
雖然一般認(rèn)為DNA探針敏感度不如cRNA探針，但在病毒的檢測(cè)等領(lǐng)域中DNA探針仍得到廣泛的應(yīng)用。
在原位雜交細(xì)胞化學(xué)的操作步驟方面與cRNA探針基本相同，所不同的是：（1)雜交時(shí)需先在高溫80～95℃短時(shí)處理，使DNA探針及細(xì)胞內(nèi)靶DNA變性，解離成單鏈，迅置于冰上冷卻。然后置于37℃～42℃雜交過夜。（2)RNA酶的溶液的沖洗不能減低背景，因此，在操作步驟中省略此步。
�。ㄒ�)地高辛-堿性磷酸酶（Dig -AKP)標(biāo)記DNA探針在石蠟包埋切片檢測(cè)病毒DNA中的應(yīng)用
1．組織前處理
（1)固定：組織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附劑的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更緊貼玻片。
�。�2)脫蠟：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/l MgCl2,pH7.3～7.4)10min×2。入0.2n HCl 20min以進(jìn)一步去除蛋白。
�。�3)50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。
�。�4)蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，)37℃20～25min。
（5)0.2mol/l 甘氨酸液：室溫10min，中止蛋白酶反應(yīng)。
�。�6)4%多聚甲醛（PBS新鮮配制)：室溫20min。
（7)PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。
（8)脫水，自低濃度到高濃度，無水乙醇各3min，空氣干燥。
2．預(yù)雜交封閉非特異性雜交位點(diǎn)，20μl/每張切片，42℃水浴半小時(shí)。
3．雜交10～20μl/每張切片，加蓋硅化蓋玻片，將切片置于95℃min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1min（也有報(bào)告用乙醇使之冷卻的)，然后將切片置于盛有2×SSC濕盒內(nèi)，42℃過夜（16～18h)。
4．雜交后漂洗
（1)2×SSC液內(nèi)振動(dòng)移除蓋片。
�。�2)2×SSc 55℃10min×2。
�。�3)0.5×SSc 55℃5min×2。
（4)緩沖液II（含0.5%封阻試劑，用緩沖液I溶解)37℃30min。
（5)緩沖液I（10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5)15min，室溫。
�。�6)酶標(biāo)地高辛抗體（1：5000，應(yīng)用緩沖液I稀釋)37℃30min。
�。�7)緩沖液i 15min×2室溫。
�。�8)緩沖液III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5)室溫2min。
5．顯色
�。�1)顯色液配制：緩沖液III：1ml中加入4.5μl四氮唑藍(lán)（NBT)，3.5μl X-磷酸鹽（5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽（BCIP配成))。30μl/每張切片，置暗處顯色30min到2h。定時(shí)抽查切片，鏡檢其顯色情況。醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com
（2)緩沖IV（10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0)10min終止反應(yīng)，甲綠復(fù)染5min，二甲苯透明，DPX封固，鏡檢。
�。ǘ�)熒光標(biāo)記DNA探針的應(yīng)用
1．概述在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中熒光標(biāo)記DNA探針（Fluorescence in situ DNA hybridisa－tion , FISH)的應(yīng)用在細(xì)胞培養(yǎng)和染色體鋪片（見二十一章 )中較為廣泛。FISH屬于非放射性標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便，快速，其敏感性可與放射性同位素標(biāo)記核酸探針相等。不少實(shí)驗(yàn)室報(bào)告應(yīng)用FISH（2～5kbp探針)可成功地達(dá)到單個(gè)拷貝（copy)的特異性定位。
2．熒光標(biāo)記DNA探針應(yīng)用于ISHH中的基本原則（Barbara Traok和Dan Pinkel 1990)
�。�1)首先應(yīng)使組織或染色體中靶核苷酸高溫加熱變性解離為單鏈DNA，化學(xué)性標(biāo)記的DNA探針除外。
�。�2)雜交：一般在37℃進(jìn)行，探針稀釋濃度在2ng/μl，染色體鋪片探針濃度在0.4ng/μl,雜交液2～3μl/每cm2蓋片，每張蓋片大約1.8cm2，約需10μl雜交液。有實(shí)驗(yàn)室報(bào)告，如每張蓋片（溫度為室溫)加入雜交液將會(huì)降低雜交溫度所需要的37℃，因此，建議對(duì)蓋片應(yīng)用前在37℃進(jìn)行預(yù)熱。
（3)用免疫細(xì)胞化學(xué)或組織化學(xué)方法顯示熒光標(biāo)記。自80年代以來，熒光素標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)日益增加。包括：①生物素標(biāo)記探針與熒光素標(biāo)記的抗生物素（avidin)或抗生物素抗體。②氨乙�；鶡晒猓╝minoacetylfluroence,AAF)-改良探針（modified probe)，與抗AAF抗血清。③磺酸（sulfonatc)改良探針，以抗磺酸抗血清檢測(cè)（Organic Ltd, Yavene, Israel和TMc Bioproducts Rockland ME可提供此藥盒)。④汞標(biāo)記探針（mercurated probe)，以硫氫基（sulf hydryl)與熒光標(biāo)記物或-半抗原相結(jié)合，再以抗半抗原抗血清檢測(cè)。⑤地高辛標(biāo)記探針，以地高辛抗血清檢測(cè)（Boehringer – Manubeim Inc, Mannhein, FRG可提供此藥盒)。在上述各例中，為簡(jiǎn)便可采用直接法（圖20-4A)，為提高敏感度可采用間接法（圖20-4B)。
圖20-4 生物素標(biāo)記核酸探針熒光免疫反應(yīng)圖解
生物素和地高辛用缺口平移法或隨機(jī)引物法進(jìn)行標(biāo)記，以用后者為多。氨乙酰熒光素，磺酸和汞的核苷酸探針標(biāo)記利用簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)。產(chǎn)生熒光的物質(zhì)各有不同，常用的有異硫氰酸熒光素（FITC)，也有應(yīng)用德克薩斯紅（texaored)獲得滿意效果的。但藻紅素（Phycoerythrin)應(yīng)用效果較差，可能由于分子大的緣故�？赏瑫r(shí)應(yīng)用AAF和生物素標(biāo)記系統(tǒng)及汞與生物素系統(tǒng)分別應(yīng)用不同的熒光素去標(biāo)記兩條DNA進(jìn)行雙重染色。
3．基本操作方法
�。�1)玻片準(zhǔn)備：細(xì)胞用甲醇：醋酸（3：1)固定，滴在玻片上可保存在-20℃，如將此載片烘烤于65℃數(shù)小時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致樣品的人工老化。應(yīng)用相差顯微鏡在低倍下定位最佳區(qū)域，或用嘴輕吹氣的方法可以看見浮動(dòng)的細(xì)胞。在玻片背面圈出蓋片應(yīng)覆蓋的區(qū)域。
�。�2)RNA酶處理：加50μlRNA酶溶液，蓋以蓋玻片，放在濕盒內(nèi)（2×SSC)37℃1h。應(yīng)用2×SSC漂洗2×3min，室溫，梯度酒精脫水（70%，90%，100%)，在空氣中干燥。
�。�3)蛋白酶K和多聚甲醛處理：對(duì)單個(gè)拷貝雜交，蛋白酶K溶液（0.3～0.6μg/ml，在20mmol/l Tris –HCl, pH7.5, 2mmol/L CaCl2)在37℃孵育2h。此法對(duì)甲醇-醋酸固定的淋巴細(xì)胞效果特佳，但這種濃度的蛋白酶K溶液對(duì)未事先經(jīng)多聚甲醛固定的染色體制片可在靶DNA變性步驟中完全破壞。因此，需根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整溶液的濃度和孵育時(shí)間。蛋白酶K消化后，以2×SSC，在室溫漂洗2min×3，再固定于4%多聚甲醛溶液中，室溫10min。2×SSC洗2min×3。
