使克隆的基因在細(xì)胞中表達(dá)對(duì)理論的研究和實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用都是十分重要的意義的�？寺〉幕蛑挥型ㄟ^(guò)表達(dá)才能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白質(zhì)在醫(yī)學(xué)上、以至在工業(yè)上都是很有應(yīng)用價(jià)值的，可以克隆其基因使之在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)而獲得。要使克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，就要將它放入帶有基因表達(dá)所需要的各種元件的載體中，這種載體就稱(chēng)為表達(dá)載體（expression vector)�？寺』蚩梢苑旁诓煌乃拗骷�(xì)胞中表達(dá)，可用大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、培養(yǎng)的哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、以至整體動(dòng)物。對(duì)不同的表達(dá)系統(tǒng)，需要構(gòu)建不同的表達(dá)載體�？寺』蛟诓煌南到y(tǒng)中表達(dá)成功的把握性，取決于我們對(duì)這些系統(tǒng)中基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律的認(rèn)識(shí)程度。
圖20-11 幾種常用的大腸桿菌表達(dá)載體
人類(lèi)對(duì)大腸桿菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，對(duì)其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達(dá)工具已有二十多年的經(jīng)驗(yàn)積累，大腸桿菌表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白量的80%。因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。設(shè)計(jì)外源基因在大腸桿菌表達(dá)就需要外源基因在大腸桿菌中表達(dá)所需要的元件，包括轉(zhuǎn)錄起始必需的啟動(dòng)子、翻譯起始所必需的核糖體識(shí)別序列等；外源基因表達(dá)的產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)大腸桿菌有毒害作用，會(huì)影響細(xì)菌的生存繁殖，所以大多數(shù)表達(dá)載體都帶有誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件，即有操縱子序列以及與之配套的調(diào)控基因等；外源基因還應(yīng)當(dāng)插入到適合于表達(dá)的位置，所以表達(dá)載體中要設(shè)有適合的多克隆位點(diǎn)；此外還應(yīng)具備基因克隆篩選的條件，包括在細(xì)胞中復(fù)制必需的復(fù)制起始序列、篩選標(biāo)志如抗藥性基因等。圖20-12中繪出幾種常用的表達(dá)載體例子。pBV220是我國(guó)科學(xué)工用者自己構(gòu)建的表達(dá)載體，使用了很強(qiáng)的PRPL雙啟動(dòng)子，含有編碼溫度敏感性阻遏蛋白的cI857基因，在30-32℃時(shí)產(chǎn)生的阻遏蛋白能阻止PRPL的轉(zhuǎn)錄起始，細(xì)菌可以正常生長(zhǎng)繁殖，42攝氏度時(shí)該阻遏蛋白發(fā)生構(gòu)像變化而失活，基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄而表達(dá)。醫(yī).學(xué)全.在.線www.gydjdsj.org.cn
圖20-12 真核表達(dá)載體pSV2-neo
當(dāng)要將真核基因放入原核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)時(shí)，原核系統(tǒng)就表現(xiàn)出許多缺陷：①?zèng)]有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行mRNA的剪接，所以只能表達(dá)cDNA而不能表達(dá)真核的基因組基因；②沒(méi)有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對(duì)和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒(méi)有足夠的生物學(xué)活性；③表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體（inclusiion body)，尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過(guò)細(xì)菌體總蛋白量10%時(shí)，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成快速太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導(dǎo)致疏水基因外露等。細(xì)菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無(wú)生物活性的不溶性蛋白，要經(jīng)過(guò)復(fù)性（renaturation)，使其重新散開(kāi)、重新折疊成具有天然蛋白構(gòu)象和良好生物活性的蛋白質(zhì)，常常是一件很困難的事情。也可以設(shè)計(jì)載體使大腸桿菌分泌表達(dá)出可溶性目的蛋白，但表達(dá)量往往不高。
要表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達(dá)系統(tǒng)自然應(yīng)比原核系統(tǒng)優(yōu)越，常用的酵母、昆蟲(chóng)、動(dòng)物和哺乳類(lèi)細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)載體至少要含兩類(lèi)序列：①原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。②在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-A信號(hào)序列、mRNA剪接信號(hào)序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)等。圖20-12舉出一個(gè)真核表達(dá)載體的例子。
