醫(yī)生需要綜合患者的病史，癥狀，及各種檢查的結果作出臨床診斷。隨著人們對疾病的病因及發(fā)病機理的認識的不斷深入，臨床檢查的手段也在不斷進步。目前看來，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生，發(fā)展都與患者遺傳背景或者其改變有關，所以臨床上越來越有必要檢查這種變化。這種用分子生物學方法檢測患者體內遺傳物質的水平或結構變化而作出的或輔助臨床診斷的技術，稱為基因診斷。
一、基因診斷的對象
1、病原生物的侵入：一般侵入體內的病原生物可通過顯微鏡檢查各免疫學方法進行診斷。但是，直接檢測病原生物的遺傳物質可以大大提高診斷的敏感性。而肝在無法得到商業(yè)化抗體時，基因診斷就成為檢測病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯一手段。此外，由于基因堿基配對原理的基因診斷可直接檢測病原微生物的遺傳物質，所以診斷的特異性也大為提高。目前，基因診斷已在病毒性肝炎，受滋病等傳染病的診斷中發(fā)揮了不可代替的作用。
2、先天遺傳性疾患：已有多種傳統(tǒng)的遺傳性疾患的發(fā)病原因被確定為特定基因的突變。例如：苯丙氨酸羥化酶基因突變可引起苯丙酮尿癥：腺苷脫胺酶基因突變可引起重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID)；而淋巴細胞表面分子CD40或其配體（CD40L)基因突變則可引起無丙種球蛋白血癥。這類疾病的診斷除了仔細分析臨床癥狀及生化檢查結果外，從病因角度作出診斷則需要用基因診斷的方法檢測其基因突變的發(fā)生。此外，有些病因尚不清楚的疾病，如高血壓、自身免疫性疾病等，都可能與某個或某些遺傳位點的持有或改變有并。用基因診斷的方法檢測這些位點的改變，不僅對臨床診斷，而且對疾病的病因和發(fā)病機理的研究都具有重要的意義
3、后天基因突變引起的疾病：這方面最典型的例子就是腫瘤。雖然腫瘤的發(fā)病機理尚未完全明了，但人們可以初步認為腫瘤的發(fā)生是由于個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖。無論是抑癌基因發(fā)生突變還是癌基因發(fā)生突變，如果確定這些改變的發(fā)生，都必須進行基因診斷。
4、其它：如DNA指紋、個體識別，親子關系識別，法醫(yī)物證等。
二、基因診斷的方法
與疾病相關的遺傳背景改變主要有兩類，一是遺傳物質，即DNA或RNA的水平的變化。例如病毒感染量病毒基因及其轉錄產物在人體內的從無到有，某些腫瘤中癌基因表達水平的從低到高。二是遺傳物質的結構變化，即基因突變，如點突變引起的基因失活，及染色體轉位引起的基因激活或滅活等等。所以從理論上說所有檢測基因水平或結構的方法都應可用于基因診斷。但如考慮其臨床適用性，靈敏度等問題，下列幾種方法可看作是有應用前景的基因診斷的方法。
1、核酸雜交：酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復后又可依堿基配對規(guī)律形成雙邊結構。雜交通常在一支持膜上進行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southern blot hybridization )和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization)。其基本過程包括下列幾個步驟。
�。�1)制備樣品：首先需要從待檢測組織樣品提取DNA或RNA。DNA應先用限制性內切酶消化以產生特定長度的片段，然后通過凝膠電泳將消化產物按分子大小進行分離。一般來說DNA分子有其獨特的限制性內切酶圖譜，所以經酶切消化和電泳分離后可在凝膠上形成特定的區(qū)帶。再將含有DNA片段的凝膠進行變性處理后，直接轉印到支持膜上并使其牢固結合。這樣等檢測片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉印在膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然后轉印并交聯(lián)固定。
�。�2)制備探針：探針是指一段能和待檢測核酸分子依堿基配對原則而結合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸雜交實驗中，探針需要被標記上可直接檢測的元素或分子。這樣，通過檢疫與恩印膜上的核酸分子結合上的探針分子，既可知道被檢測的核酸片段在膜上的位置，也就是在電泳凝膠上的位置，也就知道了它的分子大小。醫(yī)學全在線網站www.med126.com
（3)雜交：首先要進行預雜交，即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結合位點。由于轉印在膜上的核酸分子已經是變性的分子，所以雜交過程中只需變性標記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應，然后洗去未結合的探針分子即可。
�。�4)檢測：檢測的方法依標記探針的方法而異。用放射性同位素標記的探針需要用放射自顯影來檢測其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法標記的探針則需要用相應的免疫組織化學的方法進行檢測。
2、聚合酶鏈反應：核酸雜交反應是一對一的反應，即膜上有一個被檢測分子時，相應就有一個標記的探針分子與它雜交。所以整個實驗敏感性主要取決于標記探針的質量和雜交后的檢測方法。在優(yōu)化的條件下，核酸雜交可檢測到pg水平的靶分子，約相當于106個分子。但是，在許多臨床情況下，即無法得到這樣的品量。這時可以用聚合酶鏈反應來擴增靶分子以特異性地增加靶分子量，達到提高敏感性的目的。
聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction ,PCR)的反應本身是在同一試管內利用DNA聚合酶催化的反應反復進行同一段DNA片段的合成（圖23-1)。聚合酶反應的模板是待檢測核酸分子：DNA可直接用于反應，而RNA則需要用反轉錄酶反轉錄成為cDNA，然后用作聚合酶反應的模板。反應的引物有兩條，分別位于待擴增DNA片段的兩端，可啟動相對方向的DNA合成。這樣從一個模板分子起始的話，經過n次聚合酶反應后就可以合成2n個模板分子。假如進行了30輪反應，則可從一個待檢分子合成出230，即約109個待檢分子。對于一段500堿基對的DNA片段來說，這大約等于1ng的DNA。所以從很小時的樣品即有可能擴增出電泳后肉眼可見的產物。
