醫(yī)生需要綜合患者的病史，癥狀，及各種檢查的結(jié)果作出臨床診斷。隨著人們對(duì)疾病的病因及發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)的不斷深入，臨床檢查的手段也在不斷進(jìn)步。目前看來(lái)，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生，發(fā)展都與患者遺傳背景或者其改變有關(guān)，所以臨床上越來(lái)越有必要檢查這種變化。這種用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的水平或結(jié)構(gòu)變化而作出的或輔助臨床診斷的技術(shù)，稱為基因診斷。
一、基因診斷的對(duì)象
1、病原生物的侵入：一般侵入體內(nèi)的病原生物可通過(guò)顯微鏡檢查各免疫學(xué)方法進(jìn)行診斷。但是，直接檢測(cè)病原生物的遺傳物質(zhì)可以大大提高診斷的敏感性。而肝在無(wú)法得到商業(yè)化抗體時(shí)，基因診斷就成為檢測(cè)病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯一手段。此外，由于基因堿基配對(duì)原理的基因診斷可直接檢測(cè)病原微生物的遺傳物質(zhì)，所以診斷的特異性也大為提高。目前，基因診斷已在病毒性肝炎，受滋病等傳染病的診斷中發(fā)揮了不可代替的作用。
2、先天遺傳性疾患：已有多種傳統(tǒng)的遺傳性疾患的發(fā)病原因被確定為特定基因的突變。例如：苯丙氨酸羥化酶基因突變可引起苯丙酮尿癥：腺苷脫胺酶基因突變可引起重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID)；而淋巴細(xì)胞表面分子CD40或其配體（CD40L)基因突變則可引起無(wú)丙種球蛋白血癥。這類疾病的診斷除了仔細(xì)分析臨床癥狀及生化檢查結(jié)果外，從病因角度作出診斷則需要用基因診斷的方法檢測(cè)其基因突變的發(fā)生。此外，有些病因尚不清楚的疾病，如高血壓、自身免疫性疾病等，都可能與某個(gè)或某些遺傳位點(diǎn)的持有或改變有并。用基因診斷的方法檢測(cè)這些位點(diǎn)的改變，不僅對(duì)臨床診斷，而且對(duì)疾病的病因和發(fā)病機(jī)理的研究都具有重要的意義
3、后天基因突變引起的疾�。哼@方面最典型的例子就是腫瘤。雖然腫瘤的發(fā)病機(jī)理尚未完全明了，但人們可以初步認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是由于個(gè)別細(xì)胞基因突變而引起的細(xì)胞無(wú)限增殖。無(wú)論是抑癌基因發(fā)生突變還是癌基因發(fā)生突變，如果確定這些改變的發(fā)生，都必須進(jìn)行基因診斷。
4、其它：如DNA指紋、個(gè)體識(shí)別，親子關(guān)系識(shí)別，法醫(yī)物證等。
二、基因診斷的方法
與疾病相關(guān)的遺傳背景改變主要有兩類，一是遺傳物質(zhì)，即DNA或RNA的水平的變化。例如病毒感染量病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人體內(nèi)的從無(wú)到有，某些腫瘤中癌基因表達(dá)水平的從低到高。二是遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，即基因突變，如點(diǎn)突變引起的基因失活，及染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。所以從理論上說(shuō)所有檢測(cè)基因水平或結(jié)構(gòu)的方法都應(yīng)可用于基因診斷。但如考慮其臨床適用性，靈敏度等問(wèn)題，下列幾種方法可看作是有應(yīng)用前景的基因診斷的方法。
1、核酸雜交：酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開(kāi)，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測(cè)樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southern blot hybridization )和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization)。其基本過(guò)程包括下列幾個(gè)步驟。
�。�1)制備樣品：首先需要從待檢測(cè)組織樣品提取DNA或RNA。DNA應(yīng)先用限制性內(nèi)切酶消化以產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的片段，然后通過(guò)凝膠電泳將消化產(chǎn)物按分子大小進(jìn)行分離。一般來(lái)說(shuō)DNA分子有其獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶圖譜，所以經(jīng)酶切消化和電泳分離后可在凝膠上形成特定的區(qū)帶。再將含有DNA片段的凝膠進(jìn)行變性處理后，直接轉(zhuǎn)印到支持膜上并使其牢固結(jié)合。這樣等檢測(cè)片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉(zhuǎn)印在膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然后轉(zhuǎn)印并交聯(lián)固定。
�。�2)制備探針：探針是指一段能和待檢測(cè)核酸分子依堿基配對(duì)原則而結(jié)合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)中，探針需要被標(biāo)記上可直接檢測(cè)的元素或分子。這樣，通過(guò)檢疫與恩印膜上的核酸分子結(jié)合上的探針?lè)肿樱瓤芍辣粰z測(cè)的核酸片段在膜上的位置，也就是在電泳凝膠上的位置，也就知道了它的分子大小。醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站www.med126.com
（3)雜交：首先要進(jìn)行預(yù)雜交，即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。由于轉(zhuǎn)印在膜上的核酸分子已經(jīng)是變性的分子，所以雜交過(guò)程中只需變性標(biāo)記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應(yīng)，然后洗去未結(jié)合的探針?lè)肿蛹纯伞?/P>
（4)檢測(cè)：檢測(cè)的方法依標(biāo)記探針的方法而異。用放射性同位素標(biāo)記的探針需要用放射自顯影來(lái)檢測(cè)其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法標(biāo)記的探針則需要用相應(yīng)的免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行檢測(cè)。
2、聚合酶鏈反應(yīng)：核酸雜交反應(yīng)是一對(duì)一的反應(yīng)，即膜上有一個(gè)被檢測(cè)分子時(shí)，相應(yīng)就有一個(gè)標(biāo)記的探針?lè)肿优c它雜交。所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)敏感性主要取決于標(biāo)記探針的質(zhì)量和雜交后的檢測(cè)方法。在優(yōu)化的條件下，核酸雜交可檢測(cè)到pg水平的靶分子，約相當(dāng)于106個(gè)分子。但是，在許多臨床情況下，即無(wú)法得到這樣的品量。這時(shí)可以用聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增靶分子以特異性地增加靶分子量，達(dá)到提高敏感性的目的。
聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction ,PCR)的反應(yīng)本身是在同一試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行同一段DNA片段的合成（圖23-1)。聚合酶反應(yīng)的模板是待檢測(cè)核酸分子：DNA可直接用于反應(yīng)，而RNA則需要用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，然后用作聚合酶反應(yīng)的模板。反應(yīng)的引物有兩條，分別位于待擴(kuò)增DNA片段的兩端，可啟動(dòng)相對(duì)方向的DNA合成。這樣從一個(gè)模板分子起始的話，經(jīng)過(guò)n次聚合酶反應(yīng)后就可以合成2n個(gè)模板分子。假如進(jìn)行了30輪反應(yīng)，則可從一個(gè)待檢分子合成出230，即約109個(gè)待檢分子。對(duì)于一段500堿基對(duì)的DNA片段來(lái)說(shuō)，這大約等于1ng的DNA。所以從很小時(shí)的樣品即有可能擴(kuò)增出電泳后肉眼可見(jiàn)的產(chǎn)物。
