發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp)至今已有十多年，在這十多年期間對Hp的研究進展飛速，已從細胞水平逐漸深入到分子水平。現(xiàn)在認為Hp是胃炎，消化性潰瘍的主要致病因素，而且與胃癌有密切關(guān)系。Hp本身的螺形，鞭毛結(jié)構(gòu)及其分泌的細菌毒素，空泡毒素，尿素酶，粘蛋白酶，過氧化氫酶，磷脂酶，熱休克蛋白，低分子趨化性蛋白質(zhì)粘附素等都與其致病相關(guān)。診斷Hp感染已從傳統(tǒng)的細菌學，免疫學手段發(fā)展到分子生物學方法，尤其是通過分析Hp核酸，已清楚Hp的部分核苷酸序列，這為聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)用于Hp研究創(chuàng)造了條件。本文就近年有關(guān)PCR在Hp研究中的應(yīng)用作一綜述。
1 PCR原理
PCR是近年發(fā)展起來的一種體外擴增特DNA片段的技術(shù)，有關(guān)它的原理許多文獻已有詳細介紹，這里只作簡述PCR的每次擴增循環(huán)包括三步，第1步為變性，在高溫下把雙鏈靶DNA拆開；第2步，在較低的溫度下使引物與靶DNA互補；第3步在中間溫度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延長，典型的PCR包括30～50循環(huán)，如此重復循環(huán)，使被擴增的靶核苷酸以幾何級數(shù)擴增，在PCR操作中，有幾點必須考慮。①選擇引物長度以15～30個堿基為宜，太短特異性不佳，太長不增加特異性而合成費用增加。②引物中應(yīng)盡量避免單高重復的核苷酸結(jié)構(gòu)，同時還要考慮引物本身的物理特性，避免經(jīng)物自身退火。③反應(yīng)的退火溫度慎重選擇，溫度高可提高特異性，但敏感性隆低，溫度低則反之。
2 引物選擇
2.1 尿素酶基因核苷酸
Hp分泌大量的尿素酶，該酶是導致哺乳動物對Hp產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要抗原，可能是Hp的重要致病因子之一，因此許多學者采用尿素酶核苷酸序列中的部分片段作為引物。Clayton等報告了Hp尿素酶基因（ureA和tureB)的核苷酸序列，篩選到ureA和tureB兩個亞單位，并測得了它們的核苷酸序列。目前有代表性的采用以尿素酶部分核苷酸順序為引物對的有：Clayton采用一對18個堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導擴增后的DNA產(chǎn)物為411個堿基對。其他學者都是以Clayton報告的Hp尿素酶基因的部分核苷酸序列為依據(jù)而設(shè)計PCR的引物。Courcoux等選擇尿一紗酶C基因中的一段294bp作PCR反應(yīng)。
2.2 16S rRNA核苷酸順序
所有細菌的rRNAs根據(jù)其大小分為三種：含120個核苷酸的5s rRNA；含1600個核苷酸的16S rRNA及含3000個核苷酸的23S rRNA。分析細菌16s rRNA現(xiàn)已作為細菌分類的一個指標。大量研究證明，Hp的部分16s rRNA與彎曲菌屬細菌顯著不同，目前采用以16S rRNA部分核苷酸順序為引物的主要有Ho等，采用一對20個堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導擴增后的DNA產(chǎn)物為109個堿基對。有些學者用PCR拉增Hp及與其相類似微生物的16s rRNA，以此來識別H.pylori，H.mustelac和 H.canis。
2.3 編碼Hp特6kD蛋白質(zhì)的核苷酸
O'Toole等報告Hp提取物中大量的26000蛋白質(zhì)，作者提出此蛋白質(zhì)是Hp特異蛋白質(zhì)，并分析編碼該蛋白質(zhì)核苷酸序列。Hammar等以此為依據(jù)，設(shè)計一對23個堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導拉增后的DNA產(chǎn)物為298個堿基對。
2.4 其它
Valentine等從基因庫中選出1.9kd的DNA片段作為探針，與19株Hp反應(yīng)都為陽性，與32種306株其它細菌均無反應(yīng)，其特異性為98.7％，假陽性是由于載體污染。由此作者從1.9kdDNA中的已知288個堿基片段中選出一對20個寡核苷酸鏈為引物，其特異引導擴增后DNA產(chǎn)物為203個堿基對。
縱觀不同學者選出的引物，這些引物都能特異地以Hp的DNA為模板，擴增Hp的部分核苷酸，而不引導擴增其它細菌的核苷酸。
3 應(yīng)用
3.1 臨床診斷
自從成功分離出Hp以來，由于Hp感染在臨床上的重要性，迫切需要一個快速敏感檢測檢測標本的方法，學者們在不斷探索各種診斷Hp感染的方法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法由于細菌生長要求高，死亡或菌量過少，則常規(guī)方法難以檢出，其它方法如同位素標記的二氧化碳呼氣試驗，費用貴，快速尿素酶試驗由于制劑標準不統(tǒng)一，消化道其它一些細菌也產(chǎn)生尿素酶，使該方法的特異性受到影響，檢測抗Hp抗體方法簡易，但很難區(qū)分是否為近期感染，隨著分子生物學技術(shù)不斷發(fā)展，最近有些實驗室采用PCR技術(shù)診斷Hp感染，取得滿意結(jié)果，Ho等采用16s rRNA的部分核苷酸序列為引物，其引物不引導拉增與Hp的16S rRNA十分相近的H.cinaedi，H.mustelac，H.hepaticus和產(chǎn)生琥珀酸沃林氏菌。檢測10份已知Hp陽性的病理切片都為陽性，另外4份胃粘膜活檢標本符合已知結(jié)果并且能檢測到不能培養(yǎng)的Hp圓球體的DNA，進一步測試從豬，狒狒和猴胃中分離的細菌，并用內(nèi)部探針與擴增的DNA產(chǎn)物雜交，提示從這些動物中分離的細菌都為Hp。Engstrand等選用的16s rRNA引物順序與Ho者不同，作者采用了反向轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，先利用反轉(zhuǎn)錄酶合成RNA，然后再擴增cDNA。其敏感性比常規(guī)PCR提高25～50倍，可檢測到2個細菌，檢測15份標本，14份標本與呼氣試驗和培養(yǎng)相同，該方法的特異性為100％，Nguycn等用該方示檢測口腔齒斑標本，18例Hp陽性病人中有7例陽性，7例未感染Hp病人中，口齒斑未測到Hp，該結(jié)果提示口腔很可能是Hp除胃以外體內(nèi)另一居留地，這也可能是有些病人抗Hp治療后復發(fā)的原因之一。Clayton等采用urcA基因的部分核苷酸序列為引物，與50株已知Hp反應(yīng)全部為陽性，與產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌，空腸彎曲菌，結(jié)腸彎曲菌及螺旋菌屬（Helicobacter)中另一產(chǎn)尿素酶的細菌H.mustelae反應(yīng)都為陰性。作者除了直接檢測胃粘膜外還檢測了石蠟包埋病理切片，效果較理想。臺灣學者設(shè)計了重疊PCR。作者選用了兩對以尿素酶基因的部分核苷酸序列為引物，當?shù)谝粚σ锏腜CR循環(huán)結(jié)束時，將其拉擴增后的DNA產(chǎn)物再進行第2對引物的PCR循環(huán)，其敏感可提高100倍，而無假陽性。作者分析了兩例擴增后DNA產(chǎn)物的部分核苷酸序列，在183個堿基對中與已報道的尿素酶基因序列有98％的同源性。Hammar等采用了編碼Hp特異蛋白質(zhì)的部分核苷酸序列為引物，27例胃粘膜標本中，19例PCR陽性，而在所有PCR陽性標本中只有15例培養(yǎng)陽性，另外唾液杯本有9例陽性。Valcntinc等還檢測了胃液標本，在13例胃粘膜活檢陽性標本中，有11例胃液標本陽性，而采集胃液比采集胃粘膜方便，只需鼻胃管即操作，對那些不易做胃鏡的病人和兒童可能是一個比較易被接受的檢測方法。Zwet等檢測了24例Hp感染病人的糞便標本，12例于胃鏡檢后進行，另外12例于奧美拉唑治療2周后進行，24例Hp感染陽性者糞便經(jīng)PCR檢測均未發(fā)現(xiàn)有Hp的DNA存在，因此得出結(jié)論，在發(fā)達國家中，Hp經(jīng)糞一口途徑播的發(fā)生率非常低，Levinsteir等也得到同樣的結(jié)果。
3.2 流行病行學研究
目前開展周密細致的Hp流行病學研究還有一定的困難，如Hp感染的傳播途徑，Hp治療后病人復轉(zhuǎn)陽性是復發(fā)還是再感染等等，主要是缺乏準確可靠，方便，易于重復的細菌學分型方法。Hp的生物學分型，血表學分型方法都有報道，但效果不理想。在分子平上，Hp全菌可溶性蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜上表明很大的一致性；用核酸內(nèi)切酶酶切HpDNA的指紋法顯示很大的差異性，但是其酶切圖譜復雜結(jié)果較難解釋。PCR作為流行病研究的工具，其敏感性遠遠超過其他方法，因而有利于確定細菌感染的來源和途徑，如檢查環(huán)境或動物傳染源。目前PCR技術(shù)用于Hp流行病學研究有：
3.2.1 酶切PCR擴增后的DNA產(chǎn)物
最早由Langenberg等報告了用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶分析Hp全基因的差異，Clayton等用各種核酸內(nèi)切酶酶不同Hp引物引導擴增后的DNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了Sau3A，Hac Ⅲ，MspⅠ和Alu Ⅰ效果較好，17株Hp都有其特異的指紋圖。36例抗Hp治療前后調(diào)查結(jié)果顯示：抗Hp治療失敗是由于細菌持續(xù)感染，F(xiàn)oxall用核酸內(nèi)切酶Hac Ⅲ酶切PCR擴增后的部分尿素酶內(nèi)切酶基因DNA，22株臨床標本有10種圖譜，其中2種圖譜分別包括5株和6株細菌。Tonodatsu等用Hac Ⅲ酶切PCR擴增后的部分悄素酶β基因，用Southern blot分析98株Hp得出：不同菌株即使經(jīng)過保藏和多次傳代后，其Southern blot圖譜仍無改變，因此認為用尿素酶基因作為DNA指紋法的探針可用于Hp感染的流行病學示蹤方面。Moorc等用核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ內(nèi)切PCR擴增后的部分尿素酶基因DNA，把21株細菌又可分為4組；如用核酸內(nèi)切酶Alu Ⅰ和Pvu Ⅰ酶切，21株細菌又可分為15組，用核酶內(nèi)切酶Sau3A內(nèi)切同組的Hp基因DNA，其酶切圖譜截然不同，提示不是相同株，比較抗Hp治療后細菌酶切圖譜，2例病人相同，1例病人不同，表明前者在治療前后感染兩種細菌，用核酸內(nèi)酶酶切PCR擴增的DNA產(chǎn)物，其圖譜比酶切細菌其因DNA圖譜簡單，易于分析，而且前者可直接采用胃粘膜標本處理，易于操作。
3.2.2 RAPD和RFLP
RAPD技術(shù)是九十年代初由Wilions等最早報道的，RAPD是random amplificd polymorphicDNA的英文字母縮寫，也有文獻稱之為AP（Arbi-trary primer)—PCR。它的原理是采用隨機選出的單一核苷酸鏈為引物，以靶DNA為模板，在多個部位引旨擴增DNA。PAPD結(jié)果為細菌株的特異性，故用此主法可區(qū)別同種細菌的不同株。Akopyanz等報道用RAPD分析Hp以選擇較短（小于10個堿基對)的寡核苷酸鏈為引物為佳，一般不超過11個堿基對，并且引種的G＋C百分含量必須大于60％，而小于50％效果不甚理想，作者用RAPD技術(shù)分析了同一醫(yī)院中分離到的60株Hp，每株細菌的DNA圖譜有很大的差異，追蹤調(diào)查3例治療病人，其治療前后RAPD圖譜完全相同。
RFLP是restriction fragment length polymorphism的英文縮寫，它的原理是設(shè)計一對（數(shù)對)適當?shù)囊�，使擴增片段包含某一個或數(shù)個多態(tài)性的限制性內(nèi)切酶識別序列。PCR后，用該限制酶酶切PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度的變化，即可做出診斷。Owen，F(xiàn)ujimoto等用以PCR為基礎(chǔ)的RFLP比較了尿至少酶基因與rRNA基因圖譜的差別，提示從尿素酶基因圖譜可知：眾多Hp培養(yǎng)物是包含有多種基因亞型的Hp混合物，因此得出結(jié)論，尿素酶基因圖譜完全根除所引起的可靠手段。Nancy等也報道了用RELP從一個病人體內(nèi)檢測出不止一種Hp菌株。
3.3 Hp分子遺傳學研究
PCR還可用于細菌的基因分離，克隆，致病因子基因的序列分析等方面的研究。Courcoax等選擇尿素酶C基因中的一段294bp對38例患者標本標進行PCR，擴增產(chǎn)物分別測序，結(jié)果所有標本在基因水平上均呈現(xiàn)出多態(tài)性，無一例核苷酸序列完全相同的標本，88％的標本，其DNA水平上的改變沒有影響相應(yīng)的氨基酸序列。認為此方法的推廣應(yīng)用或許能夠弄清抗Hp治療4周后再次出現(xiàn)的Hp究竟是復發(fā)（recrudescence)還是再次感染（reinfection)這個問題，并可用于了解Hp的傳播途徑。
綜上所述，隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)在Hp研究中有很大的前途，它具有高效，特異，敏感，快速，簡便等優(yōu)點，標本運輸條件不高，甚至可以郵寄，并可作為Hp流行病學研究的一種工具，但是PCR的高敏感性也可能是它潛在的一個致命弱點，極少Hp的DNA污染，PCR過度擴增都可導致假陽性，因此合理選擇DNA擴增循環(huán)次數(shù)，實驗室布局合理，操作小心謹慎，不污染樣品有仔細設(shè)置對照等都是不可忽視的因素，通過這些步聚可以盡可能地克服PCR潛在的缺點，推動Hp的研究進一步深入到分子水平。
劉岱青 陸德源 張振華
上海第二醫(yī)科大學（上海 200025)
