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清肝抑纖飲及其拆方對肝纖維化大鼠TGF-β1的影響
0 引言
肝纖維化是慢性肝病最常見的病理改變之一，是指肝臟纖維結(jié)締組織的過度沉積，其病理特征為匯管區(qū)大量纖維組織異常增生，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑，而TGF-β1 是肝纖維化過程中最重要的促肝纖維化因子。肝纖維化是肝硬化的前趨階段，既可逆轉(zhuǎn)至正常，又可繼續(xù)發(fā)展成肝硬化，所以抗肝纖維化的研究是近年來肝病研究中的熱點。本文通過整方與不同拆方間對比，研究清肝抑纖飲預(yù)防用藥對CCl4 致肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1及TGF-β1mRNA的影響，以探討清肝抑纖飲防治肝纖維化的作用機制。
1 材料與方法
1.1 動物
SPF 級雄性Wistar 大鼠，110 只，體重160-180g。標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。
1.2 動物用藥
清肝抑纖飲組（A 組)：蒲公英15g、生甘草6g、敗醬草15g、丹參12g、赤芍15g、三七9g、百合15g、枸杞15g、五味子6g；清熱解毒組（B 組)：蒲公英15g、生甘草6g、敗醬草15g；涼血活血組（C 組)：丹參12g、赤芍15g、三七9g；補腎柔肝組（D 組)：百合15g、枸杞15g、五味子6g；合藥1 組（E 組)：B 組+C 組；合藥2 組（F 組)：B 組+D 組；合藥3 組（G 組)：C 組+D 組。藥物水煎濃縮處理。A 組含生藥0.972 g/ml，B、C、D 組含生藥0.648 g/ml，E、F、G 組含生藥0.324 g/ml。
1.3 動物造模用藥
CCl4 分析純；市售花生油。CCl4 與花生油以4：6 配成體積分?jǐn)?shù)為40％ 的CC14-花生油溶液備用。
1.4 主要試劑和儀器
TGF-β1 及TNF-α ELISA 試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；EasyScript First-StrandcDNA Synthesis SuperMix 購自北京全式金（ Transgen ) 公司： β-actin 上游引物：TGTTGTCCCTGTATGCCTCTG、下游引物：ACCGCTCATTGCCGATAGTG；TGF-β1 上游引物：ACCGCAACAACGCAATCTATG、下游引物：AAAGCCCTGTATTCCGTCTCC。DL2000 Ladder Marker（條帶組成100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp)、瓊脂糖、溴化乙錠（EB)購自寶生物工程（大連)有限公司；X Easy Taq、PCR SuperMix 購自北京全式金（Transgen)公司。
美國伯樂BIO-RAD 680 型酶標(biāo)儀；酶免大師 V1.0 分析軟件：北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司；德國Leica DM4000B 光學(xué)顯微鏡；德國Leica Qwin V3 圖像分析軟件；法國GILSON 公司移液器；美國Bio-rad 伯樂MyCycler 梯度PCR 儀；凝膠電泳儀；BIO-RAD 紫外分析儀；微型離心機；BECKMAN 超低溫離心機；全系列伯樂Bio-rad 電泳儀。
1.5 動物分組及處理
110 只Wistar 大鼠隨機分為9 組（A 組、B 組、C 組、D 組、E 組、F 組、G 組、模型組、空白對照組)。除空白對照組外均給予四肢或背部皮下注射40%CCL4-花生油溶液，按照0.3ml/100g，每周注射兩次，同時給予相應(yīng)中藥及生理鹽水灌胃，共8 周。8 周后處死大鼠，取同部位同樣大小肝組織1 塊，液氮速存，同時于相同部位取1.0×1.0×1.0cm 大小肝組織低溫下加生理鹽水做成10％的勻漿待測。
1.6 檢測指標(biāo)及方法
1.6.1 固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA)檢測TGF-β1 步驟
分別于反應(yīng)孔內(nèi)加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品（1:20 蒸餾水稀釋)和待測樣品50 μl；37 ℃溫育30 min；加入50 ul 的酶標(biāo)記的溶液，蓋上板膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min；甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4 次；每孔加入底物A、B 各50 μl，輕輕振蕩混勻，37℃溫育15 min，避免光照；取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μl 終止液，加入終止液后立即測定結(jié)果；于450 nm 波長處測定各孔的OD 值，以吸光度OD 值為縱坐標(biāo)（Y)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)（X)，做得相應(yīng)的曲線，根據(jù)其OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR)檢測TGF-β1 mRNA
�。�1) RNA 抽提 取約100 mg 組織放于玻璃研磨器內(nèi)，加0.2 ml 的Trizol 溶液，研磨組織后，倒入1.5 ml EP 管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8 ml 的Trizol 溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10 下，室溫靜置5 min。每1 ml Trizol 中加0.2 ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋醫(yī)學(xué).全在線gydjdsj.org.cn，用手用力搖晃試管15 s，使其充分混勻，室溫靜置5 min。后12000 rmp 離心15 min。將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5 ml EP 管中（約400-500 ul)，加入0.5 ml 異丙醇，混勻后放于-20℃中1 小時，后12000 rmp 離心10 min。倒掉上清，留取沉淀，加1 ml 75%的乙醇（預(yù)冷)振蕩洗滌RNA 沉淀一次，后7500 rmp 離心5 min。倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺開風(fēng)機吹干，再在管中加20 μl 的DEPC 水溶解，在55-60 ℃下孵育10 min 助溶。提取的RNA 保存于-70℃超低溫冰箱中。
�。�2) 第一鏈cDNA 合成（20 μl 體系)，如表1 所示。42 ℃ 孵育30 min；85 ℃加熱5 min 失活EasyScript RT。
（3) PCR 反應(yīng)（20 ul 體系)，如表2 所示。循環(huán)參數(shù)如下：94℃ 3 min 熱啟動進(jìn)入循環(huán)；35 個循環(huán)：94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72℃延伸30 s，經(jīng)35 個循環(huán)擴增后72℃終延伸10 min。
�。�4) PCR 產(chǎn)物電泳 1.5%TAE 瓊脂糖凝膠EB 染色，上樣量5 μl，電壓80 V/電流40mA，電泳40 min，進(jìn)行紫外分析。
1.7 統(tǒng)計方法
所有數(shù)據(jù)以SPSS17.0 for Windows 統(tǒng)計軟包進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料多樣本均數(shù)比較采用one-way ANOVA 軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以X ±S 表示。
2 實驗結(jié)果
2.1 TGF-β1 固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測結(jié)果
由中可以看出，模型組肝組織勻漿TGF-β1 濃度明顯高于空白對照組，經(jīng)統(tǒng)計，兩者比較有顯著性差別，P<0.01。各治療組均可降低TGF-β1 的肝組織濃度，其中清肝抑纖飲全方組與清熱解毒+涼血活血組TGF-β1 濃度值下降明顯，與模型組比較，均有顯著性差異，P<0.01。清肝抑纖飲全方組療效優(yōu)于清熱解毒+涼血活血組，但兩組間比較無顯著性差異。其他各治療組也不同程度使肝組織勻漿TGF-β1 下降，按照療效由強至弱依次為：F 組、G組、B 組、D 組、C 組，其中F 組、G 組、B 組分別與模型組相比，均有顯著性差異，P<0.05。
2.2 RT-PCR 法檢測TGF-β1 mRNA 表達(dá)
擴增產(chǎn)物行電泳后，可見β-actin 及TGF-β1 片段大小分別約為348 bp、308 bp。RT-PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行光度掃描，以TGF-β1/β-actin 的光度比值表示TGF-β1 表達(dá)水平。模型組比值明顯高于空白對照組（P<0.01)。各治療組中，A 組、E 組及F 組比值下降明顯，分別與模型組相比，均有顯著性差異，P 值均小于0.01。A 組療效優(yōu)于E、F 組，與E 組間比較無顯著性差異。余治療組中按療效由強至弱依次為G組、B 組、D 組、C 組，其中G 組與模型組比較亦有顯著性差異，P<0.01。
3 討論
肝纖維化的形成是細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用、相互調(diào)節(jié)的結(jié)果，細(xì)胞因子作為免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，它們通過旁分泌和自分泌方式作用于靶細(xì)胞特定受體，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，發(fā)揮局部生物學(xué)效應(yīng)。在眾多的細(xì)胞因子中，以TGF-β1 與肝纖維化形成的關(guān)系最為密切，為現(xiàn)知的最強烈的肝纖維化促進(jìn)因子，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、黏附、轉(zhuǎn)移、ECM 成分的表達(dá)、降解以及免疫反應(yīng)。在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中具有活化HSC、促進(jìn)膠原基因表達(dá)、促進(jìn)ECM 合成與沉積的作用，是肝纖維化最重要的始動因子之一，其表達(dá)水平與肝纖維化嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)，是目前研究最深入的致肝纖維化的細(xì)胞因子。
肝臟含量最高且具有生物活性的是TGF-β1，可促使HSC 轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并分泌膠原纖維；具有強烈促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用，可上調(diào)HSC 表達(dá)I、Ⅲ、Ⅳ型膠原和LN，促進(jìn)靜息HSC 的激活；并通過抑制MMPs 的合成、促進(jìn)TIMPs 及纖溶酶原激活物抑制因子-1 的生成而抑制ECM 降解。此外，尚能促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞等合成和分泌TGF-β、表皮生長因子等促纖維化細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活HSC，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[2-5]。
本文針對肝纖維化病因病機的主要環(huán)節(jié)，組方清肝抑纖飲，取丹參、敗醬草共為君藥，前者和血活血，化瘀通絡(luò)，后者清熱解毒，針對病因；赤芍、蒲公英為臣藥，涼血活血，兼清肝經(jīng)郁熱；百合、五味子、枸杞三者補肝腎陰，以固其本，三七活血化瘀，佐助君藥，生甘草既有清熱解毒之功，又兼調(diào)和諸藥之用。采用動物實驗的方法，通過整方與不同拆方間對比，探索清肝抑纖飲預(yù)防用藥對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 及TGF-β1 mRNA 的影響，結(jié)果顯示模型組TGF-β1 水平明顯高于空白對照組，經(jīng)統(tǒng)計，有顯著性差別，P<0.01，與文獻(xiàn)報道一致[6-7]。清肝抑纖飲及其拆方預(yù)防用藥可顯著降低纖維化大鼠肝組織勻漿TGF-β1含量，各治療組中以全方組與清熱解毒+涼血活血組效果最為明顯，分別與模型組比較，均有顯著性差別（P<0.01，P<0.01)。全方組療效優(yōu)于清熱解毒+涼血活血組，經(jīng)統(tǒng)計，無顯著性差異。RT-PCR 法檢測TGF-β1 mRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物行電泳后, TGF-β1 mRNA條帶位于308 bp ,以TGF-β1/β-actin 的光度比值表示TGF-β1 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果與肝組織勻漿檢測的TGF-β1 濃度結(jié)果一致。以上結(jié)果充分說明，清肝抑纖飲及其拆方能從mRNA到蛋白水平顯著降低肝組織內(nèi)TGF-β1 的表達(dá)，從而阻斷纖維化形成過程中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)傳遞，是其防止肝纖維化形成和抑制其進(jìn)展的重要作用環(huán)節(jié)之一。拆方研究發(fā)現(xiàn)，清肝抑纖飲組與合藥1 組在降低肝組織勻漿TGF-β1 含量上無顯著性差別，因此推測，清熱解毒藥物與涼血活血藥物的配伍在方中起主要作用。
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