醫(yī)學(xué)生物學(xué)-網(wǎng)絡(luò)教學(xué):實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

《醫(yī)學(xué)生物學(xué)》（六版教材)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

供臨床、預(yù)防、口腔、麻醉、影像、檢驗(yàn)、法醫(yī)專業(yè)用

前　　言

醫(yī)學(xué)生物學(xué)是一切生命科學(xué)的重要基礎(chǔ)學(xué)科。近幾十年來醫(yī)學(xué)生物學(xué)發(fā)展迅速，其研究成果廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)教育中重要的基礎(chǔ)課程。掌握醫(yī)學(xué)生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究方法對于從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)工作是十分必要的。

隨著分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展和滲透，醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究范疇不斷拓寬，內(nèi)容不斷深化，在教學(xué)中要求不斷更新，知識結(jié)構(gòu)不度不斷改善。生物實(shí)驗(yàn)主要針對本科生醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要而編寫的。編入的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料力求體現(xiàn)多樣性和多層次性。

醫(yī)學(xué)生物學(xué)共編入實(shí)驗(yàn)7個(gè)，內(nèi)容涉及顯微鏡技術(shù)、細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞顯微測量、細(xì)胞化學(xué)成分顯示、細(xì)胞分裂、系譜分析、人及小鼠染色體制備、染色體分析。對每一實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的室驗(yàn)原理、技術(shù)方法以及注意事項(xiàng)均有充分的闡述，并設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)報(bào)告中包括注字、繪圖、填空、簡述、識別、選擇等，以考察學(xué)對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的掌握。

一．目的要求

1．掌握學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的基本知識。

2．熟悉實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。學(xué)生固定坐號、顯微鏡號；明確實(shí)驗(yàn)室規(guī)則；明確顯微鏡各部件名稱、使用和保養(yǎng)

3．熟練掌握光學(xué)顯微鏡的使用、小鼠和人的染色體標(biāo)本制備技術(shù)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的解剖、人類X染色質(zhì)標(biāo)本的制備、細(xì)胞的顯微測量，熟悉細(xì)胞化學(xué)成分顯示的原理、體細(xì)胞有絲分裂和生殖細(xì)胞減數(shù)分裂在顯微鏡的不同、人類染色體核型分析，了解各種細(xì)胞及細(xì)胞器的形態(tài)特征。

二．注意事項(xiàng)

1、課前準(zhǔn)備工作

⑴按教學(xué)進(jìn)度表的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，參看教學(xué)大綱和教材有關(guān)內(nèi)容，明確實(shí)驗(yàn)課的目的要求和內(nèi)容．

⑵攜帶教材、教學(xué)大綱、教學(xué)進(jìn)度表、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、繪圖紙、刀、小尺、橡皮擦和鉛筆進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室．

⑶按編號領(lǐng)取顯微鏡入坐．

2、實(shí)驗(yàn)課要求

⑴ 遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則．

⑵根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)正確使用顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)內(nèi)容．觀察中應(yīng)參看教學(xué)大綱和教材，積極思維，分清主次，注意局部和整體的關(guān)系、平面和立體的關(guān)系、理論和實(shí)際的關(guān)系、結(jié)構(gòu)和機(jī)能的關(guān)系．

⑶在看懂并理解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，進(jìn)行觀察、操作、解剖等．在做實(shí)驗(yàn)過程中隨時(shí)完成本單元

《醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告》所規(guī)定的全部內(nèi)容，繪圖必須按照生物繪圖的要求進(jìn)行，禁止涂色。

3、課后復(fù)習(xí)工作
根據(jù)教學(xué)大綱結(jié)合講課和實(shí)驗(yàn)課所學(xué)內(nèi)容，對教材進(jìn)一步復(fù)習(xí)，整理心得筆記，鞏固所學(xué)知識．如遇問題，可在輔導(dǎo)時(shí)間答疑．

項(xiàng)目編號：030501

項(xiàng)目名稱：光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造及使用

項(xiàng)目性質(zhì)：觀察性、必修

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

實(shí)驗(yàn)分組人數(shù)：1人

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法：

[ 目的要求 ]

1．熟悉普通光學(xué)顯微鏡的主要構(gòu)造及其性能

2．掌握低倍鏡及高倍鏡的使用方法

3．初步掌握油鏡的使用方法

4．初步學(xué)習(xí)掌握顯微鏡臨時(shí)裝片的制備

5．初步訓(xùn)練鏡下繪圖的能力

[ 實(shí)驗(yàn)材料 ]

1．器具 顯微鏡、載片、紗布、蓋片、吸水紙、滴管、滴瓶、剪刀、鑷子、擦鏡紙、鏡油、美蘭染液、牙簽

2．材料 字母裝片、繡球葉表皮裝片、洋蔥表皮裝片、蒸餾水、蛙血涂片、細(xì)菌涂片、洋蔥

[ 光學(xué)顯微鏡的使用方法 ]

1．準(zhǔn)備工作及觀察要求

（1)將顯微鏡小心地從鏡箱中取出（較長距離移動(dòng)顯微鏡時(shí)應(yīng)以右手握住鏡臂，左手托住鏡座)，放置在實(shí)驗(yàn)臺上偏左側(cè)，以鏡座后端離實(shí)驗(yàn)臺邊緣約3~6cm為宜。

（2)檢查顯微鏡的各個(gè)部件是否完整和正常，如果是鏡筒直立式光鏡，可使鏡筒傾斜一定角度以方便觀察。但傾斜角度一般應(yīng)超過45°，否則顯微鏡重心不穩(wěn)，易發(fā)生傾倒。

（3)使用顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)，要求雙眼同睜，雙手并用，逐步養(yǎng)成左眼觀察、右眼看圖，左手調(diào)焦、右手移片或繪圖記錄的習(xí)慣。

2．低倍鏡的使用方法

（1)調(diào)光：打開實(shí)驗(yàn)臺上的工作燈，轉(zhuǎn)粗調(diào)螺旋，使鏡筒略升高（或使載物臺下降)，調(diào)節(jié)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡轉(zhuǎn)到工作狀態(tài)（即對準(zhǔn)通光孔)，當(dāng)鏡頭完全到位時(shí)，可聽到輕微的扣碰聲。

打開光圈并使聚光器上升到適當(dāng)位置（以聚光鏡上端透鏡平面稍低于載物臺平面的高度為宜)，然后用左眼向著目鏡內(nèi)觀察（注意勿閉右眼)，同時(shí)調(diào)節(jié)反光鏡的方向，使視野內(nèi)的光線均勻、亮度適中。

（2)放片：取一張玻片標(biāo)本，先對著光線用肉眼觀察標(biāo)本的全貌和位置，再將玻片標(biāo)本放置到載物臺上用標(biāo)本移動(dòng)器上的彈簧夾固定好，注意使有蓋玻片或標(biāo)簽的一面朝上。然后轉(zhuǎn)動(dòng)移片器的螺旋，使需要觀察的標(biāo)本部位對準(zhǔn)物境。

（3)調(diào)焦：用眼睛從側(cè)面注視低倍境，同時(shí)用粗調(diào)螺旋使鏡頭下降（或載物臺上升)，直至低倍鏡頭距玻片標(biāo)本的距離小于6mm（注意操作時(shí)必須從側(cè)面注視鏡頭與玻片的距離，以避免鏡頭碰破玻片)。然后用左眼在目鏡上觀察，同時(shí)用左手慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋使鏡頭上升（或使載物臺下降)直至視野中出現(xiàn)物像為止，再轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)螺旋，使視野中的物像最清晰。

如果需觀察的物像不在視野中央，甚至不在視野內(nèi)，可用標(biāo)本移動(dòng)尺上下左右移動(dòng)標(biāo)本的位置使物像進(jìn)入視野并移至中央。在調(diào)焦時(shí)如果鏡頭與玻片標(biāo)本的距離已超過了1cm還未見到物像，應(yīng)嚴(yán)格按上述步驟重新操作。

3．高倍鏡的使用方法 使用高倍鏡前一定要在低倍鏡下找到物象后，把要放大的部分移動(dòng)到視野中央，然后按照高倍鏡的操作程序進(jìn)行。

（1)轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，從側(cè)面注視物鏡換入高倍鏡，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)速度要慢，注意聽到卡扣的固定聲響，才算準(zhǔn)確換入，特別當(dāng)心高倍鏡是否觸碰玻片，如碰及玻片證明低倍鏡的焦距沒有調(diào)節(jié)好，應(yīng)依法重作。

（2)調(diào)節(jié)物距，用左眼自目鏡觀察（右眼不閉)。這時(shí)物象往往不清晰，右手慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)輪，轉(zhuǎn)動(dòng)范圍不宜太大，一般只須向上轉(zhuǎn)動(dòng)半圈或一圈，就能清晰地看到物象，在特殊情況下，有的顯微鏡須向下轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)輪或多轉(zhuǎn)幾圈才能使物象清晰，這要根據(jù)自己所用顯微鏡的情況而定，切忌用粗調(diào)節(jié)輪代替細(xì)調(diào)節(jié)輪。

（3)更換玻片標(biāo)本，應(yīng)該先轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)輪，提高鏡頭，才能取下玻片標(biāo)本。切勿急于推移，以防磨損鏡頭。

有些顯微鏡在低倍鏡準(zhǔn)焦的狀態(tài)下直接轉(zhuǎn)換高倍鏡時(shí)會(huì)發(fā)生高倍物鏡碰擦玻片而不能轉(zhuǎn)換到位的情況，此時(shí)不能硬轉(zhuǎn)，應(yīng)檢查玻片是否反放、玻片是否過厚以及物鏡是否松動(dòng)等情況后重新操作。如果調(diào)整后仍不能轉(zhuǎn)換，則屬高倍鏡鏡頭過長，此時(shí)應(yīng)將載物臺下降或使鏡筒升高后再轉(zhuǎn)換，然后在眼睛的注視下使高倍鏡貼近蓋玻片，再邊觀察目鏡視野邊用粗調(diào)螺旋極緩慢地使載物臺下降或鏡筒上升，看到物像后再用細(xì)調(diào)螺旋準(zhǔn)焦。

4．油鏡的使用方法

油鏡的放大倍數(shù)比高倍鏡要大，所以透鏡較小，為了使透過鏡頭的光線集中，以使清楚地觀察物體，所以使用油鏡時(shí)要在玻片上加一滴鏡油。

（1)使用時(shí)，加鏡油一滴于標(biāo)本蓋片上，并將標(biāo)本放在載物臺上，用載片推進(jìn)器固定好，先用低倍鏡對好光然后轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤換用油鏡。將油鏡放正，這時(shí)從側(cè)面觀察并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)輪使鏡筒下降，使油鏡頭接觸油滴，并使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸，但千萬不可壓住標(biāo)本片，以免損壞鏡頭。

（2)用左眼自目鏡觀察并慢慢向內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)輪使鏡筒上升。（注意此時(shí)只準(zhǔn)向內(nèi)不準(zhǔn)向外轉(zhuǎn)動(dòng)，以免壓碎裝片，損壞鏡頭)。當(dāng)視野中出現(xiàn)有模糊的被觀察物體時(shí)，再改用細(xì)調(diào)節(jié)輪向內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)直到所觀察的物體清楚為止。如果視野不亮可將光圈放大。

（3)如果再向內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)輪時(shí)鏡頭已離開油滴，但還未找到物體時(shí)，可以自側(cè)面觀察將鏡頭下降重新操作。

（4)鏡油使用后，必須用擦鏡紙擦去鏡頭上的鏡油，先用擦鏡紙沾點(diǎn)二甲苯擦拭鏡頭，然后再用干擦鏡紙將鏡頭擦干，否則固定鏡頭的膠質(zhì)能被二甲苯溶解，日久鏡片則自行脫落。

（5)用以上方法觀察細(xì)菌裝片

[ 觀察 ]

1．字母裝片

2．繡球葉表皮裝片的觀察  在低倍鏡下觀察時(shí)可見多為不規(guī)則的細(xì)胞，中間有核，保衛(wèi)細(xì)胞較小，常呈腎形，兩個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞間的空隙即為氣孔。

選擇一個(gè)輪廓清晰的細(xì)胞，以細(xì)胞核為標(biāo)準(zhǔn)，反復(fù)移動(dòng)玻片標(biāo)本，熟練所需方位的移動(dòng)，并在低、高倍鏡下比較細(xì)胞壁、細(xì)胞核的放大和清晰的程度。

3．洋蔥表皮裝片的觀察  在顯微鏡下可見洋蔥磷葉表皮是由許多略呈長方形的細(xì)胞組成。每個(gè)細(xì)胞外均有一層很厚的粉紅色的細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)可見園形或橢圓形粉紅色的細(xì)胞核。

4．蛙血涂片觀察  蛙血涂片經(jīng)瑞氏染液染色后，正常結(jié)果是紅細(xì)胞質(zhì)為粉紅色或桔黃色，紅細(xì)胞核為蘭紫色，白細(xì)胞的核也為蘭紫色。如果某種原因染色過酸或過堿時(shí)，紅細(xì)胞和白細(xì)胞的顏色有所改變。取蛙血涂片先置于低倍鏡下觀察，可見有許多橢圓形的紅細(xì)胞，選擇分散均勻的細(xì)胞，換用高倍鏡觀察，可見紅細(xì)胞內(nèi)有橢圓形的蘭紫色核，仔細(xì)觀察還可找到白細(xì)胞，白細(xì)胞比紅細(xì)胞少，細(xì)胞核有多種形狀。它們各染成什么顏色？

5．  哺乳動(dòng)物血涂片觀察  小鼠血涂片經(jīng)瑞氏染液染色后，正常結(jié)果紅細(xì)胞粉紅色或桔黃色，白細(xì)胞的細(xì)胞核為蘭紫色，血小板小而不規(guī)則，常聚集成群，經(jīng)瑞氏染液染色后，呈蘭紫色。如某種原因染色過酸或過堿時(shí)，上述顏色有所變化。取小鼠血涂片先置于低倍鏡上觀察，可見有許多園形的紅細(xì)胞（沒有細(xì)胞核)，選擇分散均勻的細(xì)胞，換用高倍鏡觀察。哺乳類的白細(xì)胞比紅細(xì)胞大，都有核。核具多種形狀，試能觀察到幾種？看完以上兩種血涂片后，請問它們的紅細(xì)胞有何區(qū)別？

[ 洋蔥鱗葉表皮臨時(shí)裝片的制備 ]

先把載片與蓋片洗凈，用左手的拇指和食指夾持載片長軸的兩端。用右手拇指與食指夾住紗布，置載片于紗布間。而后以兩指沿載片兩面來回帶動(dòng)紗布，直到擦試干凈。擦?xí)r用力要均勻，以免把載片弄碎，尤其是蓋片很薄易碎，同法擦試蓋片。

在擦試干凈的載片中央加水一滴（約一粒黃豆大小)，用鑷子夾住蓋片一邊或用拇指和食指拿住蓋片的兩邊，使蓋片一邊先接觸載片和水，然后慢慢斜放蓋片，避免氣泡產(chǎn)生。如水分過多，用吸水紙從蓋片的一邊吸出些，如氣泡太多則應(yīng)重做，依法反復(fù)練習(xí)多次。

用解剖鑷子撕下約2—3mm大小洋蔥磷葉表皮（越薄越好)，再置于載片中央的水滴中（如產(chǎn)生皺褶，應(yīng)輕輕展平)。蓋上蓋片即可觀察。將做好的洋蔥鱗葉表皮臨時(shí)裝片，置低倍鏡下觀察，可見洋蔥鱗葉表皮是由許多略呈長方形的細(xì)胞組成的，換用高倍鏡觀察，每個(gè)細(xì)胞外邊均有一層很厚的、由纖維素構(gòu)成的細(xì)胞壁（一般在顯微鏡下呈雙線狀)，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，常位于細(xì)胞中央或靠近細(xì)胞邊緣，有時(shí)反復(fù)調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)輪，或許可以看到核內(nèi)有一個(gè)或兩個(gè)折光率較強(qiáng)的核仁。在細(xì)胞邊緣部分可見到細(xì)微顆粒的細(xì)胞質(zhì)，再選擇一個(gè)細(xì)胞核位于邊緣的細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)觀察，在細(xì)胞中央部分可見充滿明亮細(xì)胞液的液泡。

[ 人腮上細(xì)胞臨時(shí)裝片]

用消毒牙簽的鈍端輕輕刮取自己腮內(nèi)側(cè)粘膜少許，置于載玻片中央的水滴中，用原牙簽輕輕攪動(dòng)使粘膜散開，依法蓋上蓋片，先于低倍鏡下找到散列的，形態(tài)輪廓清晰的細(xì)胞，再換高倍鏡仔細(xì)觀察，上皮細(xì)胞扁平而不規(guī)則，內(nèi)為透明的細(xì)胞質(zhì)，中央有一個(gè)橢圓形細(xì)胞核，可以觀察用美蘭染色的標(biāo)本，細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰。

染色法，在蓋片一邊滴一滴美蘭液，從蓋片的相對邊用吸水紙將水吸出，美蘭液則隨之布滿整個(gè)蓋片而使標(biāo)本著色。

[ 生物繪圖方法和注意事項(xiàng) ]

1．每一個(gè)學(xué)生應(yīng)準(zhǔn)備好鉛筆（HB)、橡皮等繪圖用具。

2．繪圖嚴(yán)格依據(jù)實(shí)物，力求真實(shí)精確、清潔有序。

3. 繪圖前應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行仔細(xì)的觀察，看清形態(tài)并識別其內(nèi)部結(jié)構(gòu)后再繪圖表示。

4. 圖右側(cè)用引線注明各部名稱，引線必須平直、均勻、不得互相交叉、字體工整。

5. 繪圖、注字、引線一律使用黑色鉛筆，不準(zhǔn)用鋼筆、圓珠筆或其他彩色鉛筆。

6. 生物繪圖不涂色，不投影，只能用線條和點(diǎn)表示。色深用密點(diǎn)，色淺用稀點(diǎn)，點(diǎn)要圓。

繪圖：人腮上皮細(xì)胞、洋蔥表皮細(xì)胞等，注明各部名稱。

[ 思考題 ]

1．使用低倍鏡觀察標(biāo)本需要那些步驟？

2．為何必須首先在低倍鏡下清楚的看到物像后才能用高倍鏡觀察？

3．舉例說明臨時(shí)裝片的制備

項(xiàng)目編號： 030502

項(xiàng)目名稱：細(xì)胞化學(xué)成分的顯示

項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)： 4學(xué)時(shí)

實(shí)驗(yàn)分組人數(shù)：1人

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法：

[ 目的要求 ]

1、了解細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的原理

2、熟悉細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的顯示

3、初步掌握動(dòng)物解剖技術(shù)

[ 實(shí)驗(yàn)原理 ]

細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的顯示

原理：細(xì)胞經(jīng)甲基綠一哌羅寧混合染液染色后，其DNA和RNA可被染上不同顏色。一般認(rèn)為這是由于兩種核酸的聚合程度不同所致。在兩種染液混染時(shí)，兩者發(fā)生竟?fàn)�，DNA（高聚分子)能被甲基綠染成綠色，RNA（低聚分子)則被派羅寧染成紅色。由于此反應(yīng)特點(diǎn)，就立即使細(xì)胞中兩種核酸從顏色方面區(qū)別出來。

[ 實(shí)驗(yàn)材料 ]

1、器具：顯微鏡、載片、蓋片、紗布、吸水紙、培養(yǎng)皿、甲基綠——哌羅寧混合染色液、、吸管、染色缸、70%乙醇、Ringer氏液、純丙酮、剪刀、鑷子、蒸餾水、1/3000中性紅染液、美蘭、鏡油、擦鏡紙。

2、材料：蟾蜍

3、試劑：甲基綠——哌羅寧混合液；Ringer氏液；1/3000中性紅染液；明膠顯影液；50%硝酸銀液。

4、試劑的配制：

（1)甲基綠——哌羅寧染液：

①  0.2mol/L醋酸緩沖液（PH4.8)

配方：冰醋（乙)酸1.2ml，加蒸留水至100ml。醋酸鈉（NaAc,3H₂O)2.72g，溶于100ml蒸餾水中，使用時(shí)兩液按2:3比例混合。

②  2%甲基綠染液

配方：去雜質(zhì)甲基綠粉（Mehyl green)2.0g 0.2mol/L醋酸緩沖液（PH 4.8)100ml.

甲基綠粉往往混有雜質(zhì)甲基紫，會(huì)影響染色效果，所以必須預(yù)先除去。方法：將甲基綠粉溶于蒸餾水中，放在分液漏斗里，加入足量的氯仿用力振搖，然后靜置，去除含甲基紫氯仿，再加入氯仿，如此反復(fù)數(shù)次，直到氯仿中無甲基紫顏色為止，最后放入40℃溫箱干燥備用。

③1%哌羅寧染液：哌羅寧（吡羅紅G,pyronin G)1.0g0.2mol/L醋酸緩沖液（PH4.8)100ml。

④臨用時(shí)將2%甲基氯液和1%哌羅寧液5：2混合即成。

（2)Ringer液

配方： 氯化鈉 8.5g、 氯化鉀 0.14g、 氯化鈣 0.12g、磷酸氫二鈉0。01g、重碳酸鈉0.20g、葡萄糖2.0g、水100ml

（3)1/3000中性紅染液：

稱取0.1g中性紅溶于300ml蒸餾水中。

（4)明膠顯影液：

配方：明膠粉0.2g、三蒸水10ml、甲酸 0.1lml

在加甲酸時(shí)要不停的搖動(dòng)，使之完全溶解。

50%硝酸銀液

配方：硝酸銀 4.0g、三蒸水8ml

以上染液用臨配，保持新鮮，染色效果好。

（5)硝酸銀甲酸混合液

稱取硝酸銀500mg，放入0.1%甲酸溶液6ml中使之充分溶解，并在20分鐘內(nèi)使用。

（0．1%甲酸溶液，取0.lml甲酸至100ml蒸餾水中)

[ 內(nèi)容與方法 ]

1．細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的顯示

蟾蜍血涂片的制備：

將蟾蜍或青蛙殺死，剪開體腔，從心臟取血，拿一張載玻片，將血液在載片的右端，另用一張邊緣光滑的載片，以其端邊緣置于血液左緣，然后稍向右退，血液就它充滿在兩玻片的余角中，再以40_­°角向左方推動(dòng)，即涂成血液薄膜。如圖3-21所示：

取一張?bào)蛤苎�涂片，�?0%醇中固定5-10分鐘，晾干后，滴甲基綠一哌羅寧混合染液于涂片上，染色20分鐘，蒸餾水沖洗用吸水紙吸去上多余水分。但血膜處不可吸得過干。然后純丙酮中浸一下進(jìn)行分色。

（3)觀察

在高倍鏡下仔細(xì)觀察紅細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)各被染上什么顏色？如能看到核仁應(yīng)被染成什么顏色？這種染色差異說明什么？

2．蟾蜍透明軟骨活細(xì)胞及動(dòng)物細(xì)胞液泡的觀察。

解剖蟾蜍，剪胸劍突軟骨邊緣最簿的部分一小塊，放入載玻片中央的1/3000中性紅染

液中，染色5—10分鐘，然后用吸管吸去中性紅染液，滴加Ringer氏液，蓋上蓋玻片，鏡檢可見，軟骨細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞核及核仁清晰可見。在細(xì)胞核的上方有許多被成玫瑰紅色的小液泡。

3．骨胳肌標(biāo)本的制備和觀察：

剪開蟾蜍腿部皮膚，剪下一小塊肌肉束（3mm)，放于載玻片用鑷子和解剖針沿著肌肉束的方向剝離肌肉束，獲得如頭發(fā)絲粗細(xì)的肌纖維，滴少許Ringer氏液，蓋上蓋玻片，置于低倍鏡下觀察，可見每個(gè)細(xì)胞上有許多細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣，緊貼細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，換高倍鏡觀察，可見細(xì)胞上有許多橫紋。

（2)制備蟾蜍脊髓壓片觀察脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞

在蟾蜍口裂處剪去頭部，除去延腦，剪開椎管，可見乳白色的脊髓，取脊髓一段（0.5厘米)放在平皿內(nèi)，用Ringer氏液（兩棲類等滲溶液)洗去血液，放在載玻片上，將另一載片壓在標(biāo)本上，用拇指壓標(biāo)本，將上面的載片抽下即可得到壓片，在壓片上滴一滴甲苯胺蘭染液，染色10分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液，在顯微鏡下觀察，染色較深的小細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，無突起，染成蘭紫色的、大的、有突起的細(xì)胞是脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞，多呈三角或星形。

10．核仁形成區(qū)的銀染顯示與觀察

（1)原理：

人類的rRNA基因位于近端著絲粒染色體（13、14、15、21、22號)短臂的次縊痕上，與核仁形成有關(guān)，因此該區(qū)域稱為核仁形成區(qū)（nucieolar organizer region NOR)。銀染方法可以特異性地將核仁形成區(qū)染成棕黑色，這種銀染陽性的核仁形成區(qū)稱為Ag—NOR。該區(qū)域即為編碼18S RNA的和28SRNA基因的分布區(qū)。當(dāng)用銀染時(shí)，具有轉(zhuǎn)錄活性的rRNA基因部分有豐富的酸性蛋白，或已轉(zhuǎn)錄過的rRNA基因上仍有殘余的酸性蛋白質(zhì)，才被銀染著色呈黑色。因?yàn)樗鼈兙哂辛驓浠�和二硫鍵，容易將Ag還原成Ag的顆粒，而沒有轉(zhuǎn)錄活性rRNA則不著色，故其著色的頻率與細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的rRNA基因相一致，銀點(diǎn)的大小也反映rRNA基因轉(zhuǎn)錄性的強(qiáng)弱。因此，計(jì)數(shù)在不同生理、病理?xiàng)l件下，細(xì)胞中銀染核仁形成區(qū)（Ag—NOR)的頻率是探討基因功能的方法之一。人類近端著絲粒染色體的隨體之間常發(fā)生聯(lián)合，可能是造成近端著絲粒染色體不分離和易位的原因，銀染技術(shù)又可作為近端著絲粒染色體聯(lián)合的客觀標(biāo)準(zhǔn)。

2．方法；

（1)取一張片齡在1周內(nèi)的染色體玻片標(biāo)本（新鮮的標(biāo)本片染色效果更好)，在片上滴加2滴明膠顯影液，然后加4滴50%AgNO₃溶液，輕搖標(biāo)本片，使兩液混勻后，即蓋上蓋玻片。

（2)將標(biāo)本放在68℃—70℃恒溫水浴箱的金屬板上，觀察片子的液體，當(dāng)出現(xiàn)大量氣泡時(shí)再輕搖片子，使染色均勻，這時(shí)可見混合物很快變黃，待1.5—2分鐘即呈棕色。

（3)取出標(biāo)本片，用蒸餾水沖去蓋玻片上的多余染液后，自然晾干鏡檢。

3． 觀察

取銀染玻片標(biāo)本，在低倍鏡下找到分散較好的中期分裂相，換油鏡觀察，可見中期分裂相中的染色體被染成黃色，而某些染色體上有銀染黑色，即為核仁形成區(qū)。凡有銀染黑點(diǎn)的染色體不論單側(cè)或雙側(cè)，都計(jì)數(shù)為已被銀染的染色體。

項(xiàng)目編號：030503

項(xiàng)目名稱：細(xì)胞及細(xì)胞器基本形態(tài)結(jié)構(gòu)與顯微測量

項(xiàng)目性質(zhì)：操作性、必修

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

實(shí)驗(yàn)分組人數(shù)：1人

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法：

[ 目的要求 ]

1、熟悉人體及動(dòng)物細(xì)胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2、了解細(xì)胞器在顯微鏡下的形態(tài)特征

3、初步掌握顯微測微尺的使用方法。

[ 實(shí)驗(yàn)原理 ]

細(xì)胞（cell)是生物體的結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。構(gòu)成人體或其他高等動(dòng)物體的細(xì)胞種類繁多、形態(tài)各異，而且這些細(xì)胞的形態(tài)與其功能往往相適應(yīng)，如具有收縮功能的肌細(xì)胞（muscle cell)呈條形或長梭形；運(yùn)輸O₂和CO₂的紅細(xì)胞（erythrocyte,red blood cell,RBC)為雙凹圓盤狀，便于在血管中流動(dòng)；具有感受刺激、傳導(dǎo)沖動(dòng)功能的神經(jīng)細(xì)胞（nerve cell)一般附有長短不一的樹枝狀突起；

 細(xì)胞的體積差別很大，一般來講，真核細(xì)胞的體積要大于原核細(xì)胞，高等動(dòng)物的卵細(xì)胞大于體細(xì)胞（卵細(xì)胞含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)——卵黃)。對于大多數(shù)人體及動(dòng)物的細(xì)胞來說，其體積一般在20～30μm之間，必須借助于光學(xué)顯微鏡才有被觀察到。由于細(xì)胞體積微小，而且含有較大比例的水，故大多是無色透明的，如果不經(jīng)染色處理，在顯微鏡下難以看清細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。因此，要觀察某種細(xì)胞時(shí)，通常先進(jìn)行染色處理。在普通光鏡下，一般可見人體及動(dòng)物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)分為細(xì)胞膜（cell membrane)、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm)和細(xì)胞核（nucleus)等外個(gè)部分。

細(xì)胞中分布有多種具有一定結(jié)構(gòu)與功能的細(xì)胞器（organelle)，它們有的體積較大，如線粒體（mitochondrion)和高爾基復(fù)合體（Golgi complex)，可通過不同的染色方法將其在光鏡下分別顯示出來，這些在光鏡下�？梢姷慕Y(jié)構(gòu)通常稱為細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)。

[ 實(shí)驗(yàn)材料 ]

1. 器具：顯微鏡、載片、蓋片、紗布、顯微測微尺、鏡油、擦鏡紙、單面刀片、

2. 材料： 平滑肌細(xì)胞分離裝片（示教)。兔脊神經(jīng)節(jié)切片——高爾基體。

兔脊髓橫切片——神經(jīng)細(xì)胞。蛙肝臟切片、豚鼠小腸切片——線粒體。

馬蛔蟲子宮切片——中心粒  馬鈴薯——淀粉粒 蟾蜍（蛙)血涂片

[ 觀察 ]

1．平滑肌細(xì)胞觀察

取平滑肌裝片在低倍鏡下觀察，可見紅色長棱形的平滑肌細(xì)胞，在細(xì)胞中央部位有一蘭色橢圓形的細(xì)胞核，細(xì)胞膜較薄。

2．神經(jīng)細(xì)胞觀察­­­

取兔脊髓橫切片，先在低倍鏡下觀察，可見脊髓分為灰質(zhì)和白質(zhì)兩部分，灰質(zhì)由許多神經(jīng)細(xì)胞組成，位于中央管的周圍，呈蝶狀，白質(zhì)位于灰質(zhì)的外圍，由大量神經(jīng)纖維構(gòu)成，換高倍鏡觀察灰質(zhì)部分，可見細(xì)胞質(zhì)被染成紅色、細(xì)胞核為藍(lán)紫色的神經(jīng)細(xì)胞，并有許多長短不一的突起，有的神經(jīng)細(xì)胞沒有見到核，這是因?yàn)闆]有切到核的部位。

高爾基體復(fù)合體

將兔神經(jīng)節(jié)標(biāo)本置于低倍鏡下觀察，可以看到脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)有許多圓形或橢圓形的神經(jīng)細(xì)胞，在細(xì)胞中央有一圓形細(xì)胞核，核的周圍有彎曲的斷斷續(xù)續(xù)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)呈深棕色。這就是高爾基體復(fù)合體，高爾基體復(fù)合體的位置一般都在細(xì)胞核外圍的某一方向，但神經(jīng)細(xì)胞的高爾基體復(fù)合體卻是圍在細(xì)胞核的周圍，視野中也可能看到一些沒有切到細(xì)胞核的細(xì)胞，其高爾基體復(fù)合體分散在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，然后換高倍鏡仔細(xì)觀察。

4．線粒體

（1)取蛙肝臟切片標(biāo)本在低鏡下觀察，在細(xì)胞內(nèi)有深蘭色的線狀物或顆粒狀物，這就是線粒體。

（2)人頰粘膜上皮細(xì)胞雙重超活染色法顯示線粒體。

①原理：超活染色法是對從活的生物體分離部分細(xì)胞和組織，使它保特著生活狀態(tài)，用活染色劑進(jìn)行染色的一種方法。

詹納斯綠（Janus Creen B)可專一地對線粒體進(jìn)行超活染色，主要由于線粒體內(nèi)有細(xì)胞色素氧化酶系存在，它能使詹納斯綠B保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài))而呈現(xiàn)淡蘭綠色，線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中的詹納斯綠B被還原成無色化合物。當(dāng)中性紅一詹納斯綠B混合染液進(jìn)行雙重超活染色后，能使線粒體顯示得更清楚。

②操作步驟：（a)將載玻片（必須十分清潔)平放在桌上，滴3—4滴中性一詹納斯綠B染液于載玻片中央。

（b)用消毒牙簽刮取口腔頰粘膜細(xì)胞（用力應(yīng)稍重些，以更能得到生活較旺盛的細(xì)胞)。然后將刮取物小心地混合于載玻片上的染液中，蓋上蓋玻片。

（c)2—3分鐘后用顯微鏡觀察，在高倍鏡下可見頰粘膜細(xì)胞質(zhì)中，散在一些短桿狀和圓形顆粒被染成亮綠色，即為線粒體。

（3)豚鼠小腸切片：取豚小腸切片，置低倍鏡下觀察，可見有許多向腸管內(nèi)突出的皺襞，稱為襞褶。換用高倍鏡，看到許多住狀細(xì)胞，并可明顯看到一染色較深卵園形細(xì)胞核，在核周圍特別是朝向腸腔的一端均有被染成深蘭色或是黑色的呈短棒狀或顆粒狀的線粒體。

5．中心粒—馬蛔蟲了宮切片

將馬蛔蟲子宮切片置于低倍鏡下觀察，可見子宮腔內(nèi)有許多圓形的受精卵，每個(gè)受精卵外均包有一層較厚的膜，這是卵殼與受精膜，這個(gè)膜與卵細(xì)胞之間的空隙為圍卵腔，在子宮腔內(nèi)尋找馬蛔蟲受精卵分裂中期的細(xì)胞。在細(xì)胞中央有被染成深蘭色條狀或棒狀的結(jié)構(gòu)，這就是染色體。在染色體兩側(cè)可見各有一較小的被染成深蘭色的小粒，稱為中心粒。

6．淀粉�！�馬鈴薯塊徒手切片觀察

用刀切取馬鈴薯塊莖一小片（越薄越好)，制成臨時(shí)裝片標(biāo)本后，于低倍鏡下選取較薄的部分進(jìn)行觀察。視野中有許多呈多角形的細(xì)胞，細(xì)胞壁清晰可見，細(xì)胞內(nèi)有一堆堆葡萄狀，具層紋結(jié)構(gòu)的顆粒，這就是淀粉分子所集結(jié)而成的淀粉粒，在含量多的細(xì)胞內(nèi)淀粉粒幾乎占滿了整個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞質(zhì)及其它構(gòu)造擠向一邊，注意觀察淀粉粒的形狀及其表面花紋。

[ 顯微測微尺的使用 ]

顯微測微尺分目鏡測微尺和鏡臺測微尺，兩尺配合使用，可以測量細(xì)胞的大小。目鏡測微尺是一個(gè)放在目鏡內(nèi)的玻璃圓片。圓片中央刻有一條直線，此線被分為若干格，每格的長度是隨不同物鏡的放大倍數(shù)而異。因此，用前必須測定。鏡臺測微尺是一張?zhí)刂频妮d玻片中央封固的小尺，長度為1mm或2mm，被分為100格或200格，每格長度為0.01mm（10μm)。

顯微測量時(shí)，先用鏡臺測微尺標(biāo)定目鏡測微尺每個(gè)小格代表的長度，然后才能用目鏡測微尺測量細(xì)胞的大小，方法如下：

1．將鏡臺測微尺放在載物臺上夾好（注意刻度面朝上)把刻度直線移到通光孔中央，用低倍鏡觀察，調(diào)準(zhǔn)焦距，看清鏡臺測微尺的刻度。

2．取下目鏡的上透鏡，將目鏡測微尺有刻度的一面朝下，放在鏡內(nèi)的光闌上，再旋上目鏡上的透鏡。

3．從目鏡中觀察目鏡測微尺和鏡臺測微尺的刻度，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡或移動(dòng)鏡臺測微尺，使兩尺平行，左邊的零點(diǎn)對齊（圖3-5-2)，從“0”點(diǎn)開始向右找出兩尺重合的直線，記錄目鏡測微尺的格數(shù)所對應(yīng)的鏡臺測微尺的長度（格數(shù))，計(jì)算出目鏡測微尺每格的長度。其公式：

  鏡臺測微尺格數(shù)

目鏡測微尺每格代表的長度（μm)=  × 10

  對應(yīng)的目鏡測微尺的格數(shù)

如在低倍鏡下所標(biāo)定的目鏡測微尺的全長（50格)等于鏡臺測微尺68格（即0.68mm)，

4．同法用高倍鏡測定目尺每格的長度，并記錄結(jié)果。

目鏡測微尺每格代表的長度為 68/50 × 10μm =13.6μm

4.同法用高倍鏡測定目鏡測微尺每個(gè)的長度，并紀(jì)錄結(jié)果。

低倍鏡下：目鏡測微尺（ )格=物鏡測微尺（ )格，目鏡測微尺每小格=（ )微米。

高倍鏡下：目鏡測微尺（ )格=物鏡測微尺（ )格，目鏡測微尺每小格=（ )微米。

5．測量細(xì)胞大�。喝∠络R臺測微尺，換上需要測量的玻片標(biāo)本，直接用目鏡測微尺的刻度測量細(xì)胞的長度，測得目鏡測微尺的格數(shù)乘以每格的微米數(shù)，則為細(xì)胞的實(shí)際長度。

（注意：為減少誤差，在測同一標(biāo)本時(shí)，需測試2次以上取其平均值)

請按以上方法測量蟾蜍的紅細(xì)胞及其細(xì)胞核的大小。

6．測量細(xì)胞體積：取下臺尺放入保護(hù)盒內(nèi)，換上蟾蜍血涂片，用目尺度量蟾蜍血細(xì)胞長度與寬度，取各自的一半為長半徑和短半徑，代入公式求出細(xì)胞體積。

7．計(jì)算： V=4/3πad²(a為長半徑、b為短半徑)

如果血細(xì)胞是圓球形，其體積V=4/3πR³（R為半徑)。為減少誤差，同一標(biāo)本需測5個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，取其平均值計(jì)算體積。

項(xiàng)目編號：030504

項(xiàng)目名稱：細(xì)胞分裂的觀察

項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性，必修

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4

學(xué)生分組人數(shù)：1

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法：

[ 目的要求 ]

1、了解細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂的過程及其分裂各期的形態(tài)待征。

2、初步學(xué)習(xí)植物根尖壓片技術(shù)。

3、進(jìn)一步掌握顯微鏡的使用方法和繪圖方法。

[ 實(shí)驗(yàn)原理 ]

有絲分裂（mitosis)是細(xì)胞分裂的方式之一，真核細(xì)胞通過有絲分裂來實(shí)現(xiàn)增殖。有絲分裂的顯著特征是形成由紡?fù)忮N體、中心體和染色體等結(jié)構(gòu)組成的臨時(shí)細(xì)胞器——有絲分裂器（mitosis apparqatus)，它起到了平均分配染色體到達(dá)個(gè)子細(xì)胞中去的作用。

植物根尖是觀察染色體的最好材料，植物根尖細(xì)胞分裂指數(shù)高，經(jīng)固定染色，加以適當(dāng)壓片或切片，可以觀察到大量處于有絲分裂過程中的染色體，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，可以人為地將有絲分裂過程分為前期、中期]、后期和末期。

減數(shù)分裂（meiosis)是生殖細(xì)胞特有的分裂方式，它包括兩次連續(xù)的分裂過程，由于染色體只在第一次減數(shù)分裂前復(fù)制1次，結(jié)果減數(shù)分裂最終產(chǎn)生的4個(gè)配子的染色體都只有原來母細(xì)胞的一半，故稱為減數(shù)分裂。

減數(shù)分裂過程與有絲分裂基本相同，主要區(qū)別在于第一次減數(shù)分裂的前期，這一時(shí)期歷時(shí)長，染色體變化復(fù)雜，是減數(shù)分裂過程中量富特性的時(shí)期。根據(jù)染色體形態(tài)特點(diǎn)，可把前期分為5個(gè)時(shí)期：細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期。

[ 實(shí)驗(yàn)材料 ]

一．器材：顯微鏡、鏡油（每桌一瓶、)擦鏡紙、載片、蓋片、吸水紙紗布鑷子、剪刀、培養(yǎng)皿等。

二．材料：洋蔥根尖縱切標(biāo)本、馬蛔蟲子宮切片標(biāo)本、蝗蟲精巢切片，洋蔥頭或大蒜頭（長出2—3厘米長的根)

三．試劑：鹽酸酒精液、醋酸洋紅染液。

四．試劑的配制：

（1) 鹽酸酒精液：

濃鹽酸1份+95%酒精1份，等量混合。

（2) 醋酸洋紅液：

把100ml、45%醋酸水溶液放入燒瓶中煮沸→移去火焰，緩慢加入1g洋紅粉未，煮沸1—2分鐘→將一枚生銹鐵釘用棉線懸入溶液約1分鐘，取出→靜置12小時(shí)，過濾到棕色瓶中避光備用。

三、植物根尖細(xì)胞有絲分裂的壓片及觀察

取洋蔥頭（或大蒜頭)置盛滿清水的燒杯上，使鱗莖盤浸沒于水中，置溫暖處，待根長2—3厘米長時(shí)，于上午11點(diǎn)左右或下午1—3點(diǎn)，在1厘米處剪取根尖。（可在課前先做好)剪下根尖一小段立即投入盛有鹽酸精液（濃鹽酸和95%酒精各半混合液)的培養(yǎng)皿中，固定離析，經(jīng)10分鐘取出用清水沖洗幾次。選擇一個(gè)經(jīng)過固定、離析、沖洗過的根尖，置于載玻片上，滴加2滴醋酸洋紅染液，染色10—15分鐘，之后蓋蓋玻片，在蓋片上加一塊吸水紙，這時(shí)用手指對準(zhǔn)蓋玻片下的材料輕輕地壓下去，把根尖壓平，使細(xì)胞分散制成壓片。把制備好的壓片放在顯微鏡下選擇有絲分裂各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞，進(jìn)行仔細(xì)觀察。

四、動(dòng)物細(xì)胞減數(shù)分裂——蝗蟲精巢切片

取蝗蟲巢切片，先用低倍鏡找到有分裂相的細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)到高倍鏡下面確認(rèn)所居時(shí)期及染色體行為，在一些切片中可以看到一個(gè)個(gè)細(xì)胞的減數(shù)分裂的不同時(shí)期。包括精母細(xì)胞到成熟的精子。雄蝗蟲染色體是2n=23其中一個(gè)是性染色體，選擇蝗蟲精細(xì)管的減數(shù)分裂區(qū)，著觀察細(xì)胞的減數(shù)分裂。

第一次減數(shù)分裂

前期→：染色質(zhì)螺旋化形成的細(xì)線狀染色體有的可見兩條同源染色體，在不同部位開始配對，配對后原來的23條染色體形成二組+X染色體，每條染色體縱裂為二，分裂成相同的兩條染色單體，此時(shí)稱為四分體，四條染色單體排列非常緊密，不易區(qū)分出四條結(jié)構(gòu)，但四分體一般很粗，染色深，這時(shí)染色體形成“+”字形成或“〇”字排，核膜消失，開始出現(xiàn)紡錘絲。

中期Ⅰ：細(xì)胞胞中染色體（色較深的一條是性染色體)排列在赤道面上，紡錘絲出現(xiàn)。]

后期Ⅰ：兩條同源染色體分開，分別向兩極移動(dòng)，每條染色體的兩條染色單體依然由于著絲粒連接在一起，而不能分開形成二分體。

未期Ⅰ：染色體移向兩極，又相互聚集在一起，逐漸形成新核，細(xì)胞短軸的兩端向內(nèi)凹入，出現(xiàn)新的細(xì)胞膜，在兩個(gè)細(xì)胞中染色體數(shù)目減半。

第二次減數(shù)分裂間期很短，染色體不復(fù)制，由次級精母細(xì)胞形成精細(xì)胞，其分裂情況與有絲分裂相同，注意在視野中找到中期能否觀察到二分體，未期Ⅱ能否觀察到單分體。

蝗蟲的初級精母細(xì)胞，經(jīng)過減數(shù)分裂形成四個(gè)精細(xì)胞，每個(gè)精細(xì)胞內(nèi)染色為n=11或n=11+×。

[ 內(nèi)容與方法 ]

一、植物細(xì)胞有絲分裂的觀察

取洋蔥根尖切片標(biāo)本于低倍鏡下觀察，找到根尖生長區(qū)，該區(qū)細(xì)胞較小，近似正方形，染色深，排列緊密。選擇細(xì)胞分裂較多的部位轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，尋找各個(gè)分裂時(shí)相的細(xì)胞。

1．前期（prophase)：早前期核膨大，染色質(zhì)呈細(xì)纖絲盤曲成網(wǎng)狀，充滿整個(gè)細(xì)胞核，隨著分裂的進(jìn)行，染色質(zhì)絲縮短變粗，到前期，到前期，染色質(zhì)凝集成染色體，核仁核膜消失，染色體分散于細(xì)胞質(zhì)中。

2．中期（metaphase)：中期染色體最粗，數(shù)目也最清楚（2n=16)，是研究染色體的有利時(shí)期。每條染色體由2條染色單體的單位是著絲粒，全部染色體的著絲粒排細(xì)胞中央同一平面上，此平面叫赤道面（板)，這是中期的主要待征。

3．后期（anaphase)：每條染色體在著絲粒處縱裂，使兩條染色單體分開，在紡錘絲的牽引下，兩組數(shù)目相等的染色單體分別向細(xì)胞的兩極移動(dòng)。

4．未期（telophase):兩組染色單體到達(dá)兩極不再移動(dòng)就是末期的開始，隨后染色體去凝集，逐漸變?yōu)榧?xì)長的絲狀，再恢復(fù)為染色持的狀態(tài)。核仁核膜重新出現(xiàn)，形成兩個(gè)細(xì)胞核，在兩新核之間產(chǎn)生細(xì)胞板，分隔細(xì)胞質(zhì)成為兩個(gè)子細(xì)胞（圖3-5-3)。

二、動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂的觀察

取馬蛔子宮切片標(biāo)本在低倍鏡下觀察，可見子宮周邊為子宮壁，壁內(nèi)為子宮腔，腔內(nèi)有許多處天不同發(fā)育階段的圓形卵細(xì)胞。每個(gè)細(xì)胞的周圍都有一層厚而染色極淡的受精膜（亦稱卵殼)，受精卵細(xì)胞在卵殼內(nèi)分裂。選擇處于有絲分裂的受精卵細(xì)胞，轉(zhuǎn)換高倍鏡下仔細(xì)觀察各個(gè)時(shí)期的圖像（圖8—2)。馬蛔蟲受精卵的有絲分裂基本上與植物細(xì)胞相似，但注意中心體的變化、星射線的出現(xiàn)和子細(xì)胞形成時(shí)橫縊的產(chǎn)生。

a. 第一極體；b.第二極體；c.雌原核； d. 雄原核；e.中心體； f.染色體； g.中心球； h.中心粒； i.星射線 j.紡錘絲

1．前期：核膨大，染色質(zhì)絲濃縮變粗形成染色體，中心粒分開向兩極移動(dòng)，中心粒之間開始形成紡錘絲，每個(gè)中心粒周圍有輻射狀的星射線，核結(jié)構(gòu)消失。

2．中期：核膜完全消失，兩面三刀中心粒已位于細(xì)胞的兩極，染色體排列在紡錘體的赤道面止，在縱切面上排列成赤道板，構(gòu)成中期的典型特征，到中期末，每條染色體已縱裂為二，但未分開，著絲粒尚未分裂。

3．后期：著絲粒縱裂，分成2組數(shù)目相等的子染色體，子染色體在紡錘絲牽引下向兩極移動(dòng)，2組成色體之間仍有紡錘絲；晚后期，細(xì)胞中部出現(xiàn)橫縊，是射線仍可見。

4．末期：染色體解旋變成染色質(zhì)，核膜重建核仁出現(xiàn)，紡錘體與星射線消失，細(xì)胞膜的

項(xiàng)目編號：030505

項(xiàng)目內(nèi)容：小鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備與觀察

項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性  必修

學(xué)時(shí)數(shù)：4學(xué)時(shí)醫(yī).學(xué)全在線gydjdsj.org.cn

學(xué)生分組人數(shù)：2—4人

[ 目的要求 ]

1．學(xué)習(xí)脊椎動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體制備方法。

2．觀察了解小白鼠染色體的基本形態(tài)特征及數(shù)目。

[ 實(shí)驗(yàn)原理 ]

染色體是遺傳物質(zhì)載體，在間期細(xì)胞核中看不到染色體，只有在細(xì)胞分裂時(shí)才能看到，當(dāng)細(xì)胞分裂處于中期時(shí)，染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)最典型、最清晰，便于鏡下觀察。骨髓細(xì)胞是具有旺盛分裂能力的細(xì)胞。不需體外培養(yǎng)，有絲分裂指數(shù)較高，但要想獲得典型的分裂中期染色體，必須要對骨髓細(xì)胞進(jìn)行處理和特殊的技術(shù)制備。在取材前4h經(jīng)小鼠腹腔注射秋水仙素或在取材時(shí)制備骨髓細(xì)胞懸液內(nèi)加入秋水仙素，這種藥物可以破壞細(xì)胞分裂過程中紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停止于中期，以便觀察到最典型的中期染色體形態(tài)。在制備過程中要進(jìn)行低滲處理，其目的在于使細(xì)胞膨脹，待滴片時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，促使中期染色體適當(dāng)分散；固定使細(xì)胞保持生活時(shí)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，保證染色體完好的形態(tài)；離心使細(xì)胞沉淀于離心管底部，以便去掉上清液保留細(xì)胞；滴片時(shí)使用預(yù)冷的栽玻片，以便使細(xì)胞黏附于玻片上；染色使染色體易分辨、觀察。該法可用于分析動(dòng)物細(xì)胞的核型，還可用于觀察毒性物質(zhì)在體內(nèi)對細(xì)胞染色體的影響。

[ 實(shí)驗(yàn)材料 ]

1．器材：普通光學(xué)顯微鏡、 低速離心機(jī)、恒溫箱、水浴鍋、8ml刻度離心管、試管架、吸管、注射器、解剖剪刀、鑷子、大培養(yǎng)皿或解剖盤、載玻片（冰水中預(yù)冷)、蓋玻片。

2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體重為20g左右的小白鼠。

3．試劑：0.04%秋水仙素、0.075mo1/L KCI低滲液、2%檸檬酸鈉溶液、3：1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆薩（Giemsa)染液（10：1)、0.85%生理鹽水。

4．試劑配制

（1)0.04%秋水仙素：秋水仙素4mg。滅菌生理鹽水10ml溶解，避光保存。

 (2)0.075mo1/L KCI 溶液：KCI5.6g加蒸餾水至1000ml。

（3)2%檸檬酸鈉溶液：檸檬酸鈉2 g，加生理鹽水至100ml。

（4)3：1固定液：甲醇3份，冰醋酸1份。

（5)吉姆薩（Giemsa)染液：原液：吉姆薩染粉0.5 g，甘油33ml，甲醇33ml，配制時(shí)先將Giemsa粉置于研缽中，加入少量甘油研磨至無顆粒，再加入余下的甘油，拌入后放入56℃溫箱中保溫2小時(shí)，然后取出加入甲醇，充分拌勻，濾紙過濾后用棕色并瓶密封，避光保存，一般要放置2周后才能使用。

使用液：原液1份，PH6.8磷酸緩沖液9份稀釋。使用液不宜長期保存，一般現(xiàn)配現(xiàn)用。

PH6.8磷酸沖液：該液可先配成A液和B液，然后混合使用。

A液：KH₂PO₄  9.078g，溶于1000ml蒸餾水中。

B液：NaHPO₄  2H₂O  11.867g，溶于1000 ml蒸餾水中。

配制各種HP值的磷酸沖液時(shí)參照下表。

各種PH值的磷酸緩沖液的配制

(6) 0.85%生理鹽水：Na CI 0.85g蒸餾水至100ml 。

[ 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法 ]

1.取材：制備骨髓細(xì)胞懸液，用頸椎脫臼法處死小白鼠，立即剝離大腿上的皮膚和肌肉，暴露股骨及其兩端關(guān)節(jié)，從兩關(guān)節(jié)處剪下股骨，去除股骨周圍殘余肌肉，剪去兩端，暴露骨髓腔，用鑷子夾住股骨中部，使股骨垂直且下端對準(zhǔn)離心管口，用注射器吸生理鹽水或2%檸檬鈉溶液，將針頭插入骨髓腔，沖洗骨髓數(shù)次，將骨髓細(xì)胞沖至離心管內(nèi)，直至股骨變白為止。一只鼠的兩個(gè)股骨的細(xì)胞沖到同一刻度離心管內(nèi)。此時(shí)離心中的細(xì)胞懸液達(dá)到5ml。用吸管吸打混勻后放入離心機(jī)，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。

2.秋水仙素處理：

(1)方法一，取材前3—4h，按2 ug/g體重的劑量向小白鼠腹腔內(nèi)注射0.04%秋水仙素。(2)方法二，在取材過程中，用生理鹽水沖洗骨髓細(xì)胞，使刻度離心管中的細(xì)胞懸液達(dá)到4ml，吸打混勻后，再加lml0.04%秋水仙素，吸打混勻放到37℃溫箱或水浴鍋中溫浴30鐘。溫浴后取出離心管放入離心機(jī)，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。

3.低滲處理：棄上清液，加37℃預(yù)溫的0.07mo1/L KCI溶液5ml用吸管吸打混勻后，至37℃溫箱或水浴鍋內(nèi)15—20分鐘。

4.固定：1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清液，加5ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1)。吸打混勻，固定10分鐘。

5.制懸液：1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清液，加固定液（0.3—0.5ml)，輕輕吸打制成細(xì)胞懸液。

6．滴片：取冰水預(yù)冷的載玻片，甩掉冰水后，平放于實(shí)驗(yàn)臺上或手持玻片，用吸管吸取細(xì)胞懸液，距玻片30—50cm，迅速滴2滴細(xì)胞懸液于預(yù)冷的載玻片上，立即對準(zhǔn)玻片吹一口氣，使細(xì)胞散開，自然干燥或于酒精燈上烤干。

7．  染色：用吸管吸取Giemsa染液于干燥的載玻片上，染色5—10分鐘，用自來水輕輕沖掉載玻片上的染液，干燥后鏡檢。

8．  觀察：將制備好的玻片標(biāo)本放在顯微鏡下，把染色的一面向上、先在低倍鏡下觀察，可見視野中有許多細(xì)胞核和染色體染色成蘭紫色或淺紅色，細(xì)胞核呈圓形，結(jié)構(gòu)致密，染色體未形成，為間期細(xì)胞核。核膜已破裂，染色體散開，此為分裂中期細(xì)胞。選擇分散適度，染色體不重疊的分裂相，在高倍鏡下進(jìn)行觀察，小鼠染色體呈“U”型，全部為端著絲粒染色體，2n=40條。按形態(tài)特征，可將40條染色體配成20對，分為4組，其中1對性染色體XY，或XX，染色體Y最小，

X的大小介于5號和6號染色體之間（如圖3-5-11)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

[ 注意事項(xiàng) ]

1．腹腔注射秋水仙素溶液時(shí)，注意不要使用針頭損傷動(dòng)物內(nèi)臟。

2．剪開股骨頭端露骨髓腔時(shí)不要剪掉太多，確保收集到一定數(shù)量的骨髓細(xì)胞。

3．離心前先配平，兩管對稱放入離心機(jī)。離心速度應(yīng)逐步增加到1000轉(zhuǎn)/分鐘；   離心后取出離心管的動(dòng)作要輕，棄上清時(shí)勿搖動(dòng)。

4．滴片時(shí)要有一定的高度。

[ 思考題 ]

1．簡述小鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備過程？

2．取材前4小時(shí)為什么要給小鼠腹腔注射秋水仙素？

3．制片過程中加入何種低滲液和固定液？其目的各是什么？

 

項(xiàng)目編號：030506

項(xiàng)目名稱：人染色體G帶制片及其核型分析

項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性   必修

學(xué)時(shí)數(shù)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：1人

[目的要求]

1．了解染色體G帶標(biāo)本的制作方法。

2．初步掌握正常人染色體G帶的形態(tài)特征。

 

[ 實(shí)驗(yàn)原理 ]

染色體顯帶是70年代發(fā)展起來的技術(shù)，其中使用最廣泛的是G帶，有許多顯示G帶的方法，最常用的是將已固定的染色體制片進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)行Giensa染色。預(yù)處理的方法非常多，如用熱堿、各種蛋白酶、尿素、去垢劑或其他溶液等。其中常用的是用胰蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理，方法簡便，周期短。G顯帶技術(shù)可使染色體顯現(xiàn)深淺交替的橫紋，由于染色體的化學(xué)組成成分有差異，故每條染色體出現(xiàn)不同的帶紋特征，根據(jù)這些帶紋特征，可對染色體進(jìn)行較為精確的辨別，是目前進(jìn)行染色體顯帶標(biāo)本分析的常規(guī)方法。廣泛應(yīng)用于人類細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷中。

 

[ 實(shí)驗(yàn)材料 ]

1．器材：普通光學(xué)顯微鏡，恒溫箱，烤箱，水浴鍋，染色缸，染色架，剪刀，漿糊，香柏油，二甲苯。

2．材料：常規(guī)未染色的人染色體玻片、正常人染色體G帶核型照片。

3．試劑：0.02%（或0.125%)胰酶、5%NaHCO₃ 3%tris溶液、1/15mo1/L磷酸緩沖液、Giemsa染液、0.02%EDTA。

[ 內(nèi)容與方法 ]

一．G顯帶標(biāo)本的制作

（一)0.02%胰酶法

1．將外周血培養(yǎng)并按常規(guī)制作的標(biāo)本置于37℃溫箱中烘烤3天，或70℃烤箱中烘烤3小時(shí)。

2．用0.85%的生理鹽水配制成0.02%的胰酶溶液，倒入染色缸中，置37℃水浴中，滴入0.4%的酚紅2滴，再以35的Tris（三羥甲基氨基甲烷)調(diào)pH為6.4～6.6（4號針頭1滴)，此時(shí)溶液為橙色。

3．將經(jīng)過烘烤的玻片取出，浸入0.02%胰酶溶液中，輕輕擺動(dòng)，處理2分30秒左右（必要時(shí)此時(shí)間可自己摸索)。

4．取出玻片，自來水沖洗。

5．將玻片標(biāo)本放，直接滴上用pH7.2的磷酸緩沖液配制的Giemsa染液（緩沖液與Giemsa原液的比例為9：1)染色7～10分鐘�；�?qū)⒉Ｆ�放入染色缸中浸�?～10分鐘。

6．自來水或蒸餾水沖洗，空氣干燥或用電吹風(fēng)吹干，鏡檢。

（二)0.125%胰酶法

1．烤片（方法同上1)。

2．用0.85%的生理鹽水配制的0.125%的胰酶溶液，倒入染色缸中，用5%的NaHCO₃調(diào)節(jié)pH為7，置入37℃水溫中，使胰酶液溫度升至37℃。

3．取烘烤三天的玻片，浸入0.125%的胰酶溶液中，稍加擺動(dòng)8～15秒。

4．取出玻片，自來水沖洗。

5．以Giemsa梁液（1：9工作液)染色5～7分鐘后水洗，空氣干燥、鏡檢。

（三)EDTA胰酶法

1．烤片（方法同上)。

2．取25ml生理鹽水和25ml0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二鈉)溶液倒入立式染色缸中混勻。

3．取2.5%的胰酶溶液1ml加入上液中，以5%NaHCO₃調(diào)pH至7左右，置水溶箱預(yù)溫存37℃。

4．將染色體玻片浸入胰蛋白酶、EDTA溶液中處理5—20秒。

5．取出標(biāo)本立即用生理鹽水洗2次。

6．以1：9Giemsa染色5—10分鐘，細(xì)水沖凈染液后鏡檢。

為使染色體帶顯示清楚，利于觀察，必須選用有足夠多的分裂相，染色體長度中的常規(guī)標(biāo)本片制片，制片時(shí)，烘干時(shí)間要足夠，而且片齡不能太長，往往一周內(nèi)效好。另外，顯帶的成敗與胰酶處理的濃度和時(shí)間很有關(guān)系。在消化處理時(shí)，最好將一張玻片分幾段浸入，摸索2—3個(gè)時(shí)間，找出在本胰酶濃度條件下最適時(shí)間。如消化過度，染色呈空泡狀，不足則帶紋顯示不出。

[G顯帶染色體標(biāo)本觀察 ]

先在低倍鏡下選擇長度適中、帶紋清晰的G帶中期分裂相，然后轉(zhuǎn)至高倍和油鏡下觀察。

G顯帶染色體上出現(xiàn)明暗交潛的橫紋（帶紋)，不同的染色體，帶紋有別，根據(jù)帶紋，可對染色體進(jìn)行比較正確的鑒別，尤其是未顯帶不易區(qū)別的染色體如C組的染色體，可通過帶紋區(qū)分，對于因病理因出現(xiàn)的染色體結(jié)構(gòu)變異常規(guī)組型難以識別，通過帶紋即可以判斷。

[G顯帶染色體核型分析 ]

核型分析是指用顯微鏡攝影方法得到的單個(gè)細(xì)胞中所有的染色體按照丹佛命名體制將同源染色體配對并分組編號排列所構(gòu)成的圖象。核型分析是診斷染色體病的重要手段。

1．將照片全部染色全逐個(gè)剪下，注意要剪得整齊，可沿染色體的黑白邊界剪彩下，也可留1—2毫米的白色邊緣。

2．將同源染色體配對，按照各號染色體的G帶待征分組列，將所有常染色體分為A—G7組，編號為1—22，性染色體（X和Y)可分別排列。

3．用漿糊將已排列好的染色體按組編號貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)紙上，注意著絲點(diǎn)或長臂末端應(yīng)排在同一水平線上，短臂向上，最后寫上報(bào)告結(jié)果：

46，XX正常女性核型；

46，XY正常男性核型；

4．人體染色G帶特征：

1號：p近著絲粒一半處有2條深帶，遠(yuǎn)側(cè)端有3—4條淺染的深帶，幾乎淺染區(qū)。q次縊痕緊貼著絲粒，染色深，近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端各有兩條深帶，中央一條最寬著色最深。

2號：p有4條深帶，中段2條�？拷�。Q有4—7條帶，著絲粒染色較淺。

3號著絲粒和臂內(nèi)區(qū)段染色相當(dāng)深，中部色淺，兩臂遠(yuǎn)側(cè)端染色更深，近似對稱，形似“蝴蝶”。P近側(cè)端有2條深帶，遠(yuǎn)側(cè)端3條深帶，而中間的一條著色更深，近側(cè)端的一條帶較窄，著色較淺。Q與p相同，只是遠(yuǎn)端的深帶比p的寬些。

4號：比5與染色體著色體著均勻，色更深。P中央有一深帶，Q有4—5條中等著色帶，近著絲粒處一條特別深。

5號：p中央有一深帶。Q近側(cè)端一條深帶，中央3條深帶，往往融合在一起，遠(yuǎn)側(cè)端1—2條深帶，其中末端染色更濃。

6號：p近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端各有一深帶，中部為一色淺的寬帶，近似“空白”。Q有4條分布均勻的中等著色帶。

7號：p兩條帶，近側(cè)端的條著色淺，遠(yuǎn)端的一條著色很深而且寬，尤如“瓶蓋”。Q 有3條均勻的深帶，近側(cè)端和中部的著色深，遠(yuǎn)側(cè)端的較淺。

8號：p有兩條均勻的深帶，中間被一淺帶隔開。Q3—4條逼帶，近側(cè)端的色較較淺，而遠(yuǎn)側(cè)端的染色較深。

9號：p中央有一較寬的深帶，q有兩條明顯均勻的深帶，遠(yuǎn)側(cè)端淺染，次縊痕通常不著色。

10號：p可見兩條深帶，不甚明顯。Q有3條分布均勻的帶，越是近側(cè)端的帶染色越深。

11號：p可見兩條深帶，有進(jìn)融為一條。Q近側(cè)端的深帶與著絲粒之間為一寬淺帶，中部兩條深帶，常融合起，遠(yuǎn)側(cè)端有一著色淺帶。

12號：p中部有一深帶。Q3條深帶，中間一條最寬，其3條深帶形成的深染區(qū)比第11號的要寬，且稍偏近側(cè)端。

13號：p隨體著分深。P有4條深帶，第1和第4帶較窄，第2和第3帶較較寬。

14號：p隨體著色不定。P4條深帶，近側(cè)端第2帶和遠(yuǎn)側(cè)端的第4帶特別明顯，中段一條色較淺。

15號：p隨體著色學(xué)定。Q近側(cè)端1/2處有一著色深的寬帶，在近末端處有一中等著色的窄帶。

16號：p著色淺，有1—2條淺染帶。Q著絲粒和次縊痕著色深，長度變異大，在2條深帶。

17號：p 著色較淺，中部有一窄深帶。q遠(yuǎn)端部可見一較寬的深帶，它與弟絲粒區(qū)之間為一寬而明顯的淺帶。

18號：p近末端處有一窄深帶。Q 近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端各有一條明顯的深帶，近側(cè)端的一條寬且深染。

19號：在核型中著色最淺，常在著絲粒處深染。

20號：p有一顯著深帶。Q 全部為淺染，有時(shí)可見1—3條帶。

21號：p隨體不定著色，著絲粒染色濃。Q近著絲粒處有一深的寬帶。

22號：隨體不定著色。Q中央有一著色較深的窄帶。

Y染色體p一般為淺染。Q遠(yuǎn)端部1/2處是核型中著色最深的區(qū)段，其長度變化不一，有時(shí)整個(gè)長臂均被成深色。

 

[ 注意事項(xiàng) ]

1．G帶制片要求染色體標(biāo)本新鮮，一般以三天內(nèi)為宜，如片齡增長，則胰酶處理時(shí)間延長。

2．胰酶溶液現(xiàn)配先用。

3．胰酶在使用過程中，隨著使用次數(shù)增多，而活力有所降低，因而較后處理的片子其時(shí)間要略有延長。

4．片子在胰酶中作用時(shí)間與溫度成反比，溫度高則處理時(shí)間短；同時(shí)與胰酶濃度成反比，即胰酶濃度高處理時(shí)間短。

5．配制胰酶溶液時(shí)，除了用生理鹽水外，還可用無Ca⁺⁺、Mg⁺⁺、Hank液和ICN液，在用ICN液配制時(shí)因內(nèi)含有磷酸緩沖液成分，故不必要調(diào)PH值。

[ 思考題 ]

1.簡述人染色體G帶制片過程。

2．簡述人染色體G帶的主要形態(tài)、特征，進(jìn)行G帶核型分析，并報(bào)告結(jié)果。

 

項(xiàng)目編號：030507

項(xiàng)目內(nèi)容：X染色質(zhì)標(biāo)本制備及正常人染色體觀察

項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：2學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：1人

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法：

[ 目的要求 ]

1．了解正常人體細(xì)胞染色體數(shù)目和形態(tài)。

2．初步掌握人高級職稱考試網(wǎng)類染色體核型常規(guī)分析方法。

3．初步掌握口腔粘膜上皮細(xì)胞X染色質(zhì)的制備方法，了解X染色質(zhì)的形態(tài)特征。

[ 實(shí)驗(yàn)原理 ]

人類的性染色體即X染色體和Y染色體在間期細(xì)胞中為性染色質(zhì)。根據(jù)Lyon假說，人類間期的X染色質(zhì)通常只有一條有轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)多于一條時(shí)，多余的X染色質(zhì)將形成異固縮染色質(zhì)塊（X小體)存在于細(xì)胞核邊緣，經(jīng)過特殊染色，可在顯微鏡下看到這一結(jié)構(gòu)，如女性細(xì)胞有兩條X染色體，因此，間期細(xì)胞可見到一個(gè)X小體，而男性細(xì)胞僅一條X染色體，故間期細(xì)胞見不到這一結(jié)構(gòu)。在性染色體異常的病人，如X染色體有3個(gè)者，則可見到2個(gè)X小體。另外，用熒光染色法，在男性細(xì)胞可見到一個(gè)較強(qiáng)的熒光體，稱為Y小體，一般認(rèn)為是由Y染色體長臂的部分結(jié)構(gòu)構(gòu)成。女性細(xì)胞元Y染色體，故見不到這一結(jié)構(gòu)。據(jù)此，通過口腔上皮細(xì)胞、羊水細(xì)胞等間期細(xì)胞的性染色質(zhì)檢查，可判斷個(gè)體的核性別，同時(shí)在臨床上也可作為性別異常疾病的一種輔助診斷。

[ 實(shí)驗(yàn)材料 ]

顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、滴管、牙簽、載玻片、龍膽紫染色色液、蓋片、吸水吸。

正常人體細(xì)胞染色體玻片標(biāo)本照片。

 

 

[ 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 ]

（一)X染色質(zhì)標(biāo)本制作和觀察

1．標(biāo)本制作方法

口腔粘膜上皮細(xì)胞X染色質(zhì)標(biāo)本制作。

（1)涂片：喇口后用潔凈的消毒牙簽從頰部內(nèi)側(cè)輕輕刮取少許口腔粘膜上皮細(xì)胞，均勻涂布于載玻片上。

（2)固定：在涂片未干燥時(shí)95%酒精固定15分鐘。

（3)染色

①龍膽紫色法：固定后的涂片用蒸餾水沖洗，稍干加一滴龍紫液染色1—2分鐘后，用水沖洗，干后即可油鏡觀察。

②硫瑾染色法：a、涂片干燥后，用蒸餾水洗數(shù)次。B、放入5N HCL（22℃)10分鐘。C、自來水洗數(shù)次。D、蒸餾水沖洗。E、硫瑾染色30分鐘。

③2%地衣紅（orcein)染色法

用一滴地衣紅滴于口腔皮涂片上，國蓋片室溫下靜置20—30分鐘，然后用過濾紙復(fù)蓋，以手輕輕加壓，并吸去周圍液準(zhǔn)備鏡檢。

細(xì)胞質(zhì)無色，細(xì)胞核略顯紅色，X染色質(zhì)呈暗戲色。

附：染液配制方法

1．地衣紅液配制法

用45%醋酸配制，臨用時(shí)等份的70%的乳酸稀釋后備用（稱此液為乳酸醋酸地衣紅固定染色液)。

2．硫瑾原液配制法

配方：硫瑾4克、50%酒精 100毫升

配制成100亳升瑾液，在與緩沖液混全前過濾。

3．緩沖液配制： 

配方： 醋酸鈉 1.94克、巴比妥鈉2.94克  

加蒸鎦水到100毫升（冰箱保存可用數(shù)月)。

4．硫瑾工作液配制法：

按下述次序逐個(gè)混合。 

（1)飽和硫瑾 100毫升、  

（2)1/10N HCL 70毫升

（3)緩沖液  60毫升

調(diào)PH為5.7（此液冰箱保存可用數(shù)用)。

 5.龍膽紫液配制未法：

配方：冰醋酸 30毫升、龍膽紫0.75克、蒸餾水70毫升

先加溫使龍膽紫溶于冰醋酸，后加蒸餾水。

觀察

油鏡觀察，計(jì)數(shù)50個(gè)可數(shù)細(xì)胞，報(bào)告X染色質(zhì)出現(xiàn)率，細(xì)胞經(jīng)染色后，胞質(zhì)著色淺，胞核著色深，輪廓清楚，選擇胞核完整，染色均勻的細(xì)胞核進(jìn)行觀察，X染色質(zhì)很小，約1微米直徑，常見于核膜內(nèi)側(cè)緣。呈半圓狀突向核中央的濃染小體，或呈三角形，其一角朝向核中央。

正常值：女性10%以上。

（二)正常人體染色體玻片一張（該標(biāo)本是人體外周血細(xì)胞通過培養(yǎng)制成的)。先在低倍鏡下觀察，在標(biāo)本中尋找一個(gè)染色體分散較好，平鋪在一個(gè)平面上互不重迭的分裂中期的細(xì)胞，然后換高倍鏡（或油鏡)仔細(xì)觀察。標(biāo)本中的每條染色體都含有兩條染色單體，兩單體邊續(xù)處為著絲點(diǎn)，注意每條染色體的大小和著絲點(diǎn)的位置各不相同并計(jì)數(shù)是否有46條染色體。計(jì)數(shù)時(shí)，要按染色體分散自然區(qū)域進(jìn)行，以免重復(fù)和遺漏。（由于制片時(shí)或個(gè)別細(xì)胞分裂受某些因素的影響，染色體數(shù)目可多于或少于46條，但46染色體出現(xiàn)的頻率最多)。按上述方法再選擇1—2個(gè)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，比較的結(jié)果是否相同。

（三)正常人體染色體核型分析

核型分析是指用顯微鏡攝影方法得到的單個(gè)細(xì)胞中所有的染色體按照丹佛命名體制將同源染色體配對并分組編號排列所構(gòu)成的圖像。核型分析是診斷染色體病的重要手段。

1．分析方法：

（1)照片中全部染色體逐個(gè)剪下，注意要剪得整齊，可沿染色體的黑白邊界剪下，也可留1—2毫米的白色邊緣。

（2)將同源染色體配對，按照染色體的長度（長者為前，短者為后)并參考著絲點(diǎn)位置及單個(gè)染色體的識別。（下表所列各組染色體的主要形態(tài)特征)所有常染色體分為A—G7組，編號1—22，性染色體（X和Y)可分別排列。

（3)和漿糊將已排列好的染色體按組編號貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙上，注意著絲點(diǎn)應(yīng)排在同一水平線上，短臂向上，最后寫上報(bào)告結(jié)果。

46××正常女性核型

46×Y正常男性核型

2．單個(gè)染色體的識別：

（1)A組（1—3)染色體

暈組染色體1、2、3是人體染色體中最大的一組，這組中的各對染色體彼此之間以區(qū)分，其標(biāo)志如下：

A₁是最大的染色體，著絲點(diǎn)基本上為中央型，長短臂差別不大。

A₂較1號小，為亞中央著絲點(diǎn)，長臂和短容易區(qū)別。

A₃著絲點(diǎn)為中央型，是A組中最小的染色體。

（2)B組（4—5)染色體

這一組一共只有兩對染色體，編號為4和5，長度僅次于A組，本組兩對染色體全部為亞中央型，長臂短區(qū)分明顯，但B₄和B₅彼此之間很難區(qū)分，B₄整個(gè)染色體的長度較B₅略長。

（3)C組（6—12)染色體

這一組共有七對常染色體（6、7、8、9、10、11、12)還有人把X染色體也歸這一組，本組染色體大小頗為一致，呈中等大小，其著絲點(diǎn)位置都是亞中央型，因此從形態(tài)上看，區(qū)別本組內(nèi)個(gè)別染色體是比較困難的。一般地說，6、7、8號染色和11號染色體短臂較長（著絲點(diǎn)的位置更接近于中部)而9、10號和12號染色體短臂較短（著絲點(diǎn)的位置更接近于端部)。第12號是C組最小的一對，但不易與組內(nèi)其它4個(gè)對較短的染色體相區(qū)別。

X染色體，因?yàn)樗�的長度也屬于中等大小，故變歸在這組內(nèi)予以描述。從大小看來，它的長度與C₀和C₇相仿佛。但其染色常比C₀和C₇為深（實(shí)際上，X染色體的染色，比其它任何染色都深些)，且其邊緣不平整。似乎有些象細(xì)毛狀的形態(tài)，其著絲點(diǎn)略偏向于亞中央型。

（4)D組（13—15)染色體

這一組染色體共有三對，編號為13、14、15，長度中等，著絲點(diǎn)近端型，它們比另一組（G組)的近端型染色體長度較大，因此又有大近端（targacrocenfril)之稱，全部都是在短臂的頂端具有隨體，所以比較容易和其它染色體組相區(qū)別。

D₁₅是本組三對染色體中較短的一對，其短臂也是本組最明顯的，所以較容易辨別。

（5)E組（16—18)染色體

本組共有三對染色體，編號為16、17、18，這三對長度均較短，其特征差異明顯，所以比較容易識別。

E₁₆本組中最大的染色體，具有中央著絲點(diǎn)。

E₁₇著絲點(diǎn)為亞中央型，其短臂較E_16­略長（但不是絕對的)。

E₁₈是組中最小的染色體，著絲點(diǎn)為亞中央型，其短臂較E₁₇為短。

（6)F組（19—20)染色體

本組共有兩對染色體，編號為19和20，是最小的一組，著絲點(diǎn)為中央型，不易把兩者區(qū)別。

（7)G組（21—22和Y)染色體

本組共有兩對常染色體，編號21號22，也有人把Y染色體歸這一組。本組染色體的著絲點(diǎn)均為近端型，它們比另一組（D組)的近端染色體的長度為小，所以這兩對被稱為“小近端”（Smallacrocenfric)知臂上有極小的隨體，但是G₂₁其長臂較G₂₂略長。

Y染色體一般比較容易與21—22相區(qū)別。首先，它不具有隨體，其次，它經(jīng)常出現(xiàn)在中期染色體相的邊緣部分，還有，一般地說，Y染色體的長臂比較長，所以整個(gè)染色體溫的長度顯得比21和22大些，不過這點(diǎn)不能作為可靠的標(biāo)志，因?yàn)槠溟L臂脹度常常出現(xiàn)形態(tài)上的變異，還有Y染色體幾乎不出現(xiàn)典型的中期那種X形的交叉圖形，因?yàn)槠溟L臂膽平行的，而且靠得得近，這是很好的辨認(rèn)標(biāo)志，還有Y染色體長臂末端呈細(xì)毛狀，端緣比較模糊，界限不清，而21和22則極為分明，相反，Y染色體的著絲點(diǎn)區(qū)和短臂較21和22明顯。

3．根據(jù)上述染色體鑒別特征，將染色體照片剪貼、配對、排出核型。

人類染色體組型分組及形態(tài)特征

組 分	染色體號	形態(tài) 大小	著絲粒位置	隨體	次縊痕	鑒別程度
A	1—3	最小	1、3為中央著絲粒，2為亞中著絲粒	無	1常見	可鑒定
B	4—5	次大	亞中著絲粒	無		不易區(qū)分
C	6—12，X	中等	亞中著絲粒	無	9常見	不易區(qū)分
D	13—15	中等	近端絲粒	有	13偶見	不易區(qū)分
E	16—18	小	16為中央著絲粒，17、18為亞中著絲粒	無
F	19—20	次小	中央著絲粒	無		不易區(qū)分
G	21—22，Y	最小	近端著絲粒	無		不易區(qū)分

注：X染色體與C組相比，大小介于6—7之間，著色較其它染色體深，在女性其中一條常呈現(xiàn)一種特殊的“細(xì)毛狀”外形，Y染色體與G組相似，但無隨體，常比21、22對略大，兩臂緊貼，幾乎是相平行的，它的長臂的端部模糊不清，呈“細(xì)毛狀”。

項(xiàng)目編號：030508

項(xiàng)目內(nèi)容：人類正常遺傳性狀的調(diào)查與系譜分析、討論

項(xiàng)目性質(zhì)：綜合性，必修

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：1人

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、方法：

 [ 人類正常性狀 ]

通過對人類某些遺傳性狀的調(diào)查，學(xué)習(xí)繪制系譜圖、分析性的遺傳方法。

[ 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 ]

1、卷舌（IoHgHe roIIiog)

在人群中，有的人能夠卷舌，在近舌尖處一兩側(cè)邊緣向上甚至卷成管狀，有的人則不能，同學(xué)間可相互觀察，或?qū)︾R觀察是否具些能力，并記錄下來。從人數(shù)分布中能否估計(jì)卷舌為顯性遺傳或隱性遺傳？同學(xué)們可對自己的家庭進(jìn)行調(diào)查、記錄結(jié)果，卷舌者記“+”非卷舌者記“-”繪成系譜圖，通過第譜分析其遺傳方式，以“T”代表顯性基因以“t”代表隱性基因，寫出直系親屬可能的基因型。

班人數(shù)	卷舌者人數(shù)	非卷知者人數(shù)	卷舌%	非卷舌%

2．耳垂（EarIobe)形狀

人類耳垂可明顯區(qū)分為有耳垂和無耳垂兩面三刀種形狀，前都為顯性遺傳，后者為隱性遺傳。試觀察你家成員的耳垂形狀，是否與上述遺傳方式想符？在你看到的人群中耳垂分布情況，能否有助于說明該遺傳問題？

3．前額發(fā)際形狀

在人群中，有些人前額發(fā)際基本上屬于平線，有些人在前額正中發(fā)際向下延伸呈峰形，這種性狀屬于哪種遺傳方式？

4．PTC嘗味敏感性

PTC是一種無毒的化藥物苯硫脲（phenglthiocarbamide)的縮寫，個(gè)體間對不同濃度的PTC溶液嘗味敏感性不同，有人嘗苦味，有人嘗無味，這是一種正常的遺傳性，可按下列方法配制溶液嘗味。

PTC飽和液（0.13%)為源液，0號液：稀釋一倍為1號液再稀釋一倍為2號液，2號液再稀釋一倍為3號液；以此類推，配成各號溶液，以1/48000（6號液)為嘗味界限，能嘗出1/48000及更稀溶液苦味者為陽性劃“+”號無味者陰性記“-”號，除自己進(jìn)行PTC嘗味測驗(yàn)外，可利用無菌吸水紙吸取PTC溶液，帶回家中調(diào)查，繪出系譜圖，并說明遺傳方式。

[ 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ]

按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、2、3、4、各項(xiàng)要求繪制系譜圖遺傳方式。

四．討論

目的

1．通過討論、鞏固、擴(kuò)大和加深所學(xué)遺傳學(xué)的基本理論和基礎(chǔ)知識。

2．培養(yǎng)和訓(xùn)練科學(xué)思維方法，以提高分析、綜合及解決問題的能力。

討  論

通過教師精講典型例題，介紹解題方法和掌握解題一般規(guī)律的基礎(chǔ)上，將他們預(yù)習(xí)中所存在的問題提出來，先經(jīng)過分組議論之后，再進(jìn)行全班討論。最后，由教師引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行小結(jié)。

幾種遺傳病的系譜分析

應(yīng)用遺規(guī)律，對下列各系譜進(jìn)行分析討論，根據(jù)各系譜的特點(diǎn)判斷其傳遞方式，并寫出患者及其父母可能出現(xiàn)的基因型，再回答有關(guān)問題。

1． 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤：在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的系譜中（圖1)為什么Ⅱ₄的家系中沒有患者？如果Ⅲ₆與正常人結(jié)婚，其后代是否會(huì)出現(xiàn)患都？Ⅱ₂和Ⅱ₃表型都正常，但他們的后代中卻出現(xiàn)了患者，這是為什么？

 

Ⅰ　　

   1   2

Ⅱ

   1  2 3   4 5 6  7

 

Ⅲ

   1   2 3  4  5   6   7  8   9  10  11   12

    圖 1  視網(wǎng)膜母細(xì)胞的系譜

2．遺傳性腎炎：在遺傳腎炎的系譜中（圖2)，Ⅲ₅為為什么沒有患��？Ⅲ₆如果與正常人結(jié)婚，其后代患同樣疾病的可能性如何？IV₁若與一正常女性結(jié)婚，他們所生的孩子患同樣疾病的可能性有多大？

Ⅰ　　

   1  2

 

Ⅱ

1  2 3  4 5  6

 

Ⅲ

   1 2  3   4   5   6  78  9

 

Ⅳ  1 2   圖 2   遺傳性腎炎得系譜

 3．糖元累積�、裥停ǜ涡�)：在糖元累積�、裥停ǜ涡�)的系譜中（圖3)，為什么在第

三代突然出現(xiàn)患者？Ⅲ₁的致病基因來自親還是父親？如果Ⅲ₁與一位患同樣疾病的男性結(jié)婚，其后代患病的可能性有多大？

　

  

Ⅰ

1  2345

　 Ⅱ

1   2 34  5   6

　 Ⅲ

　　　1 2 34

 

  

圖3   糖元累計(jì)病I型 (肝型) 的系譜

4．血友病A：在血友病A的系譜中（圖4)為什么男性患者眾多？Ⅱ₂的致病基因來自誰？為什么？如果Ⅲ₂與正常人結(jié)婚后，所生的孩子患此病的可能性有多大？

 

  

Ⅰ

  1   2   3  45   6

 

Ⅱ

  1  2   3  4      5  6

 

Ⅲ

 12 34 5   6

圖4  血友病A和系譜

5．某家庭ABO血型和紅綠色盲的調(diào)查結(jié)果如下面的系譜圖（圖5)

 

  A  O A O  AB   O

12 34 56

 

     AB A      B        B      A    A

  1 2 3   4 5  6   78   9 10  11

 

  AB  O  A   B  AB B  O A

   1   2  3  4 5 6  7 8  9 10  11

圖 5  ABO 血型及紅綠色盲遺傳病的系譜

注：  ╔╗

╚╝ 男性色盲目患者   〇  里的英文字母表示血型

（1)Ⅲ₇的色盲基因，是從世代Ⅰ中的哪個(gè)個(gè)體傳遞來的？

（2)如果當(dāng)Ⅲ₂和Ⅲ₇結(jié)婚，他們所生男孩患色盲的可能性究竟有多大（設(shè)色盲基因頻率為0.07)？

（3)如果Ⅲ₇和Ⅲ₁₀結(jié)婚，他們所生女孩成為色盲基因攜帶者占多大比例？

（4)如果對這個(gè)家系的世代Ⅰ、Ⅱ的成員其血型判斷是正確的，那么，在世代Ⅲ中便有一個(gè)個(gè)體的血型記錄是錯(cuò)誤的，他該是哪一個(gè)？

（5)如果對（圖5)中的那個(gè)小孩的母親的血型判斷是正確的，試根據(jù)小孩的同胞正確血型推斷出他父親的血型。

（6)從這個(gè)系譜你能判斷出色盲的傳遞方式嗎？其根據(jù)是什么？

6、設(shè)某病為常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率為1/10000（圖 6)

Ⅰ

   1 2

 

 

Ⅱ

1   2   3 4 5 6  7     8

 

Ⅲ 1 2 3   4

 

Ⅳ   1

  圖 6 

求：

（1)Ⅲ₁與Ⅲ₂婚配，其后代發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

（2)Ⅲ₁隨機(jī)婚配，其后代發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

（3)Ⅲ₄隨機(jī)婚配，其后代發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

（4)IV₁隨機(jī)婚配，其后代發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

（5)若系譜中未出現(xiàn)患者，表兄妹婚配后代的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

7．某病遺傳度為75%，群體發(fā)病率為0.14%，求一級親屬發(fā)病率。