一、實驗?zāi)康?/STRONG> 1、了解薄層色譜基本原理 2、掌握薄層色譜的基本方法 二、實驗原理 薄層色譜，或稱薄層層析(thin—1ayer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質(zhì)的特別有效的層析方法，從50年代發(fā)展起來至今，仍被廣泛采用。
(一)基本原理
薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板(常用玻璃板，也可用滌綸布等)上形成薄層，然后用相應(yīng)的溶劑進(jìn)行展開。薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實驗中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。
吸附是表面的一個重要性質(zhì)。任何兩個相都可以形成表面，吸附就是其中一個相的物質(zhì)或溶解于其中的溶質(zhì)在此表面上的密集現(xiàn)象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發(fā)生吸附現(xiàn)象。
物質(zhì)分子之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相等。在固體內(nèi)部，分子之間相互作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡、吸附與解吸的動態(tài)平衡過程。
薄層層析有許多優(yōu)點：它保持了操作方便、設(shè)備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，一般僅需15～20分鐘；混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10～100倍，它既適用于只有0．01μg的樣品分離，又能分離大于500mg的樣品作制備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點是對生物高分子的分離效果不甚理想。
(二) 固定相支持劑的選擇和處理
在薄層層析時，對支持劑的選擇主要考慮兩方面：一是支持劑的性質(zhì)與適用范圍；二是支持劑的顆粒大小。一般來說，所選吸附劑應(yīng)具有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)有不同的吸附能力，即有足夠的分辨力；所選吸附劑與溶劑及樣品組分不會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。吸附力的強弱規(guī)律可概括如下：吸附力與兩相間界面張力的www.gydjdsj.org.cn/sanji/降低成正比，某物質(zhì)溶液中被吸附的程度與其在溶劑中的溶解度成反比。極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。同族化合物的吸附程度有一定的變化方向，例如，同系物極性遞減，而被非極性表面吸附的能力將遞增。 1、支持物的性質(zhì)與適用范圍
薄層層析的支持劑較常用的是硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚酰胺及DEAE—纖維素。
(1)硅膠 硅膠是應(yīng)用最廣泛的一種極性吸附劑。它的主要優(yōu)點是化學(xué)惰性，具有較大的吸附量，易制備成不同類型、孔徑、表面積的多孔性硅膠，一般以SiO2?xH2O通式表示。硅膠的吸附活性取決于含水量，吸附層析一般采用含水量為10％～12％的硅膠，含水量小于1％的活性最高，而大于20％時，吸附活性最低。用加熱脫水法可使硅膠活化，降低吸附活性的硅膠能顯著改善分離性能，增加樣品的負(fù)載量。
硅膠適用于分離酸性和中性物質(zhì)，堿性物質(zhì)能與硅膠作用，因此如用中性溶劑展開，堿性物質(zhì)有時留在原點不動，或者斑點拖尾，而不能很好地分離。為了使某一類化合物得到滿意的分離，可改變硅膠酸堿性。例如，可用稀酸或稀堿液(0．1～0．5mol／L)或一定pH值的緩沖溶液代替水制備酸性、堿性或某一pH值的薄層；也可在硅膠中加入氧化鋁(堿性)制成薄層；或在展開劑中加入少量的酸或堿進(jìn)行展層。
使用硅膠和硅藻土?xí)r，通常要先加入粘合劑再在支持板上涂布。常用的粘合劑為煅石膏和淀粉，在硅膠、氧化鋁和硅藻土中分別加入5％～20％石膏后，稱為硅膠G、氧化鋁G和硅藻土G。用煅石膏為粘合劑的薄層易從玻璃板上脫落，但具有耐腐蝕性試劑的優(yōu)點。加淀粉制成的薄層，機(jī)械性能較好，但不宜用腐蝕性強的試劑。
(2)氧化鋁 氧化鋁為微堿性吸附劑，適用于親脂性物質(zhì)的分離制備，氧化鋁具有較高的吸附容量，價格低廉，分離效果好，因此應(yīng)用也較廣泛。
在使用氧化鋁作吸附層析時，要注意選擇適當(dāng)活性及適當(dāng)酸堿度的產(chǎn)品。氧化鋁通�？砂粗苽浞椒ú煌譃閴A性、中性和酸性三種。堿性氧化鋁可應(yīng)用于碳?xì)浠衔锏姆蛛x；中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、某些苷類及酸堿溶液中不穩(wěn)定的酯、內(nèi)酯等化合物的分離；酸性氧化鋁適用于天然及合成的酸性色素以及醛、酸的分離。
(3)聚酰胺 聚酰胺由己二酸與己二胺聚合而成，也可用己內(nèi)酰胺聚合而成，因它們都含有大量酰胺基團(tuán)，故統(tǒng)稱聚酰胺。
聚酰胺薄膜層析是1966年后發(fā)展起來的一種薄層層析方法，用此方法分析氨基酸衍生物DNP一氨基酸、PTH一氨基酸、DNS一氨基酸及DABTH一氨基酸時，具有靈敏度高、分辨力強、展層迅速和操作簡便等優(yōu)點。目前由國產(chǎn)原料制成的聚酰胺薄膜性能良好、效果滿意，已用于酚類、醌類、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸堿基、核苷、核苷酸、雜環(huán)化合物、合成染料；磺胺、抗菌素、環(huán)酮、殺蟲劑及維生素B等16類化合物的分析。
(4)硅藻土和纖維素 它們是中性支持劑，需在吸附水、緩沖溶液或甲酰胺等之后，才能用于薄層層析。 2、支持劑的顆粒大小 用作薄層層析固定相的支持劑顆粒，要求大小適當(dāng)、均勻。顆粒過大，展開時溶劑推進(jìn)速率太快，分離效果不好；顆粒太小，展開太漫，斑點拖尾不集中，分離效果也差。顆粒大小固定在一定范圍內(nèi)并且薄層厚度均勻一致時，每次得出的Rf值即可保持恒定。無機(jī)類支持劑的顆粒以150～200目(直徑為0．07～0．1mm)、薄層厚度為0．25～1mm較合適。有機(jī)吸附劑如纖維素等的顆粒為70～140目(直徑0．1～0．2mm)、薄層厚度為1～2mm最恰當(dāng)。 (三)薄層板制作 薄層板制作簡稱制板，是指作為固定相的支持劑被均勻地涂布在玻板上，形成一薄層。所用的玻板要求表面平滑、清潔。玻板的大小按需要選定，常用的規(guī)格為6cm×20cm、20cm×20cm及2．5cm×7．5cm。 1、軟板制作
軟板也稱干板，是不加粘合劑，將支持劑干粉直接均勻地鋪在玻板上制成的。這種薄層板制作簡單，展開快，但極易吹散。其具體制作方法如下： (1)選用直徑約為0．5cm的玻璃管一根，根據(jù)薄層的厚度(一般為0．4～1mm)在其兩端繞膠布數(shù)圈。
(2)將支持物干粉倒在玻板上，固定玻板一端以防玻璃推進(jìn)時移動。 (3)將玻璃管壓在玻板上，將支持劑干粉由一端推向另一端即成薄層。 2、硬板制作 &nb執(zhí)業(yè)護(hù)士網(wǎng)sp;硬板或稱濕板，是將支持劑加粘合劑和水或其他液體后，均勻地鋪在玻璃板上，再經(jīng)烘干而成的薄層板。制作方法可用專門的薄層制板器，也可用手工，均能得到滿意的效果。下面介紹三種手工涂布制板的方法： (1)玻棒涂布 將支持劑用水或適當(dāng)溶劑調(diào)成膠漿，倒在玻板上，然后依軟板制作相同方法，用玻棒在玻板上將支持劑由一端向另一端推動，即成薄層。 (2)玻片涂布 在玻板兩旁放置兩塊稍厚的玻板，把支持劑膠漿倒在中間的玻板上，然后用另一塊玻片的邊緣將膠漿刮向另一端，即成一定厚度的薄層。干燥后用刀刮去薄板兩側(cè)的支持劑。更換玻板兩旁不同厚度的玻片，即可調(diào)節(jié)薄層的厚度。 (3)傾斜涂布 將支持劑膠漿倒在玻片上，然后將玻板傾斜，使膠漿均勻涂布于玻板上。上述任何一種方法將支持劑均勻涂布于玻板上后，靜置片刻，待薄層表面無水漬后，置烘箱中，讓溫度升到100℃，持續(xù)1小時。關(guān)閉電源，待溫度降至接近室溫時，取出薄層板，放入干燥器備用。此一步驟稱為活化。 (四)點樣 點樣是將經(jīng)處理后的樣品點加在薄層的特定部位，這是一項需要十分仔細(xì)的操作步驟，點樣的好壞會直接影響分離效果。點樣可用玻璃毛細(xì)管，如作定量測定，應(yīng)使用微量移液管或微量注射器，市售血球計數(shù)管經(jīng)加工磨尖頭部并標(biāo)定體積后使用也甚理想。點樣的位置，上行展開法一般點樣在離薄層下端4～5cm處，下行展開法在離上端6～8cm處。如作雙相紙層析分離，點樣處應(yīng)位于距薄層右側(cè)邊5cm與距底邊5cm直線的交點。 薄層層析點樣方法應(yīng)注意以下幾點： (1) 樣品最好用具揮發(fā)性的有機(jī)溶劑(如乙醇、氯仿等)溶解，不應(yīng)用水溶液，因水分子與吸附劑的相互作用力較弱，當(dāng)它占據(jù)了吸附劑表面上的活性位置時，就使吸附劑的活性降低，而使斑點擴(kuò)散。
(2) 點樣量不宜太多，否則會降低Rf值，一般為幾到幾十μg，體積為1～20μg。 (3) 原點直徑要控制在2mm以內(nèi)。欲達(dá)此目的，就須分次點樣，邊點樣，邊用冷、熱風(fēng)交替吹干。 (4) 薄層板在空氣中不能放置太久，否則會因吸潮降低活性。 (五)展開 1、展開劑的選擇 選擇展開劑須視被分離物的極性及支持劑的性質(zhì)而定。對初選展開劑合適與否的評價，要根據(jù)其分離有效成分的效果來確定。如果不合適，還需進(jìn)行極性調(diào)整，直到達(dá)到對有效成分的完全分離為止。
如果薄層層析所用的支持劑是吸附劑，在同一吸附劑上，不同化合物的吸附性質(zhì)有如下規(guī)律：①飽和碳?xì)浠衔锊灰妆晃�；②不飽和碳�(xì)浠衔镆妆晃剑肿又须p鍵愈多，則吸附得愈緊密；③當(dāng)碳?xì)浠衔锉灰粋�功能基取代后，吸附性增大。吸附性較大的化合物，一般需用極性較大的溶劑才能推動它。 選擇展開劑的另一個依據(jù)是溶劑的極性大小。一般而論，在同一種支持劑上，凡溶劑的極性愈大，則對同一性質(zhì)的化合物的洗脫能力也愈大，即在薄層上能把此化合物推進(jìn)得愈遠(yuǎn)，Rf值也愈大。如果用一種溶劑去展開某一成分，當(dāng)發(fā)現(xiàn)它的Rf值太小時，可考慮換用一種極性較大的溶劑，或在原來的溶劑中加入一定量極性較大的溶劑進(jìn)行層層。溶劑極性大小的次序是：
石油醚<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<乙酸甲酯<丙酮<正丙醇<甲醇<水。 關(guān)于溶劑混溶性，一般根據(jù)相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶，比如正己烷與甲醇。多元展開劑，主體的兩種溶劑不能混溶，就需要通過第三種溶劑來調(diào)和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、環(huán)已烷和甲醇、水之類的。 2、展層 展層裝置種類較多，根據(jù)展層方式基本上可分上行、下行、連續(xù)及水平式四種。不加粘合劑的薄層只能作近水平式(板與水平成10度～20度角)的上行或下行展開。不論何種展層方式，展層容器必須關(guān)閉，并事先要使展開劑蒸氣達(dá)到飽和。容器的體積大小要視薄層板的面積而定，因為大容器要達(dá)到溶劑蒸氣飽和所需的時間比小的長。根據(jù)實驗證明，在不飽和的展層裝置中，由于混合展開劑內(nèi)含有幾種揮發(fā)性試劑，致使薄層板邊緣與中間的試劑比例不同，因此樣品在邊緣和中間展層的距離也不同，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)，嚴(yán)重時會影響分離效果。 薄層層析時為了獲得更好的分離效果，可采用雙向展層和分次展層。分次展層是先用一種溶劑展開至一定距離后，將薄層板取出，待溶劑揮發(fā)后再按同一方向用第二種溶劑展開。 (六)顯色和定量
薄層板展開完成后，從展開裝置中取出，于室溫或烘箱中干燥，然后根據(jù)被分離物質(zhì)的種類和性質(zhì)，選用相應(yīng)的顯色劑噴霧顯色，或用紫外燈檢測被分離的物質(zhì)斑點，測量和計算各斑點的Rf值。通過薄層層析被分離的各種溶質(zhì)組分在濾紙上移動的速率通常用Rf表示：
Rf＝組分移動的距離／溶劑前沿移動的距離
＝原點至組分斑點中心的距離／原點至溶劑前沿的距離。 在薄層、溶劑、溫度等各項實驗條件恒定的情況下，各物質(zhì)的Rf值是不變的，它不隨溶劑移動距離的改變而變化。Rf與分配系數(shù)K的關(guān)系： Rf＝1／(1+αK)，
α是由薄層性質(zhì)決定的一個常數(shù)。由此可見，K值愈大，溶質(zhì)分配于固定相的趨勢愈大，而Rf值愈��；反之，K值愈小，則分配于流動相的趨勢愈大，Rf值定性分析的重要指標(biāo)。
在樣品所含溶質(zhì)較多或某些組分在單相薄層層析中的Rf比較接近，不易明顯分離時，可采用雙相薄層層析法。該法是將濾紙在某一特殊的溶劑系統(tǒng)中按一個方向展層以后，即予以干燥，再轉(zhuǎn)向90度，在另一溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行展層，待溶劑到達(dá)所要求的距離后，取出薄層，干燥顯色，從而獲得雙相層析譜。應(yīng)用這種方法，如果溶質(zhì)在第一種溶劑中不能完全分開，而經(jīng)過第二種溶劑的層析能得以完全分開，大大地提高了分離效果。
由于薄層層析在分析定量時需注意以下幾點：
(1)在噴霧顯色時，不加粘合劑的薄層要小心操作，以免吹散吸附劑。
(2)薄層層析還可以用強腐蝕性顯色劑，如硫酸、硝酸、鉻酸或其他混合溶液。這些顯色劑幾乎可以使所有的有機(jī)化合物轉(zhuǎn)變?yōu)樘�，如果支持劑是無機(jī)吸附劑，薄層板經(jīng)此類顯色劑噴霧后，被分離的有機(jī)物斑點即顯示黑色。此類顯色劑不適用于定量測定或制備用的薄層上。
(3)如果樣品斑點本身在紫外光下不顯熒光，可采用熒光薄層檢測法，即在吸附劑中加入熒光物質(zhì)，或在制備好的薄層上噴霧熒光物質(zhì)，制成熒光薄層。這樣在紫外光下薄層本身顯示熒光，而樣品斑點不顯熒光。吸附劑中加入的熒光物質(zhì)常用的有1．5％硅酸鋅鎘粉，或在薄層上噴霧0．04％熒光素鈉、0．5％硫酸奎寧醇溶液或1％磺基水楊酸的丙酮溶液。
(4)由于薄層邊緣含水量不一致，薄層的厚度、溶劑展開距離的增大，均會影響Rf值，因此在鑒定樣品的某一成分時，應(yīng)用已知標(biāo)準(zhǔn)樣作對照。
(5)定量時，可對斑點作光密度測定，也可將一個斑點顯色，而將與其相同Rf值的另一未顯色斑點從薄層板上連同吸附劑一起刮下，然后用適當(dāng)?shù)娜軇⿲⒈环蛛x的物質(zhì)從吸附劑上洗脫下來，進(jìn)行定量測定。
(七)薄層層析法的近代發(fā)展
薄層層析法由于其本身所具有的許多優(yōu)點，幾十年來，在混合物的分離、定性及定量分析中的應(yīng)用相當(dāng)普遍，并逐漸取代了紙層析分離技術(shù)。為了克服薄層層析法存在的某些不足，獲得更有效的分離效果，在薄層制備、展開方式、分析鑒定手段以及相配套的儀器設(shè)備等方面近年來進(jìn)行了許多革新，其中最根本的是支持劑的改進(jìn)。以一種直徑更小的支持劑顆粒替代常規(guī)的支持劑劑型所制備的薄層，比常規(guī)的薄層具有所需樣品少、展開速率快、距離短、分辨力高等優(yōu)點；而且此種新型的薄層具有較好的光學(xué)特性，更有利于對分離斑點進(jìn)行光密度掃描。為了區(qū)別于常規(guī)的薄層層析分析法，通常將此種新方法稱為高效薄層層析法(high performance thin—layer chromatography，HPTLC)，也稱現(xiàn)代薄層層析法(modern TLC)。
在進(jìn)行HPTLC時，為了保證恒定的吸附劑活性和薄層板的相對濕度，預(yù)制板可用固定相浸漬劑加以處理。經(jīng)處理后的薄層板一般不再受外界濕度的影響。固定相浸漬劑分兩類：①親水性固定相，多數(shù)用甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙二醇和不同相對分子質(zhì)量的聚乙二醇或不同種類的鹽溶液浸漬；②親脂性固定相，一般作反向?qū)游鲇�，多�?shù)用液體石蠟、十一烷、十四烷、礦物油、硅酮油或乙基油酸鹽等浸漬。也有利用與浸漬劑形成絡(luò)合物或加成物得以分離的，如經(jīng)三硝基苯或苦味酸浸漬的，可利用絡(luò)合反應(yīng)分離多環(huán)化合物。用NaHSO3浸漬，可與含有羰基化合物生成加成物而得以分離。 三、實驗儀器和試劑 玻板（12×5cm) 干燥器 培養(yǎng)皿（10～12cm) 燒杯（100ml) 量筒（25ml) 小木架 涂鋪薄層板玻棒 毛細(xì)管 米尺 濾紙 細(xì)線 薄層色譜用堿性氧化鋁 展開劑 飽和KCl水溶液 碘片 咖啡堿溶液（2%) 茶堿溶液（2%) 混合生物堿溶液 四、實驗步驟 ⑴制板 用玻棒在玻板上均勻地鋪上一層活性三氧化二鋁。 ⑵點樣 先用細(xì)線在薄層板上距下端1～1.5cm處壓一條線，注意不要把三氧化二鋁壓斷，用毛細(xì)管蘸取少量樣品點于線上，樣點之間及樣點與薄層板邊緣之間距離都不宜太近，且樣點的形狀越規(guī)則越好，大小不宜超過3mm。 ⑶展開 晾干樣點，斜著放入置于干燥器中盛有展開劑的培養(yǎng)皿中。展開劑要接觸到吸附劑下沿，但切勿接觸到樣點。蓋上干燥器蓋子，展開。待展開劑上行到一定高度（由試驗確定適當(dāng)?shù)恼归_高度)，取出薄層板，再畫出展開劑的前沿線。 ⑷顯色，計算Rf值 將展開的薄層板揮發(fā)干展開劑后，放在盛有碘晶體的封閉容器中，升華產(chǎn)生的碘蒸氣能與有機(jī)物分子形成有色的締合物，完成顯色。計算Rf值。 五、思考題 1、展開時，展開劑的高度超過了點樣原點，這對薄層色譜產(chǎn)生什么影響？ 2、運用薄層色譜定性鑒定時，只用一種展開劑展開，然后根據(jù)Rf值作判定是否可靠？ 3、為什么在薄層色譜時，不能讓展開劑從薄板上蒸發(fā)掉？ | 
