病理學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)教學(xué)-電子教材:病理學(xué)常用新技術(shù)原理及應(yīng)用

圖18-3食管鱗癌 E-cad膜強(qiáng)陽性   圖18-4 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞GFAP胞漿胞膜陽性  圖18-5肺硬化性血管瘤 TIF-1核陽性

陰性對(duì)照

（１)空白對(duì)照：用ＰＢＳ置換第一抗體；

（２)血清替代對(duì)照：用同種動(dòng)物的正常血清代替第一抗體；

（３)抑制對(duì)照：用未標(biāo)gydjdsj.org.cn/zhuyuan/記的抗體先和相應(yīng)的抗原結(jié)合；

（４)吸收對(duì)照：用純化的抗原對(duì)抗體先行吸收；

陽性對(duì)照：用已知或已被實(shí)驗(yàn)證明為陽性的組織；

自身對(duì)照：利用組織切片內(nèi)的各種不同的組織成分作對(duì)照。 

2．假陽性反應(yīng)：

⑴ 非特異性反應(yīng)：邊緣現(xiàn)象、皺折和刀痕、出血和壞死等；

⑵ 內(nèi)源性過氧化物酶：紅細(xì)胞、炎細(xì)胞、退變壞死細(xì)胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含過氧化物酶的組織，如腦、肝等；

⑶ 抗體的交叉反應(yīng)：抗體本身含有與人體組織發(fā)生交叉反應(yīng)的成分；  

⑷ 試劑濃度過高或失效。

3．假陰性反應(yīng)：

⑴ 組織固定不當(dāng)或固定時(shí)間過長；

⑵ 抗體效價(jià)過低或久置失效；

⑶ 組織中抗原被粘稠基質(zhì)或分泌物阻隔；

⑷ DAB或H₂O₂的濃度不當(dāng)。 

五、免疫組織化學(xué)在腫瘤診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用

（一)在腫瘤診斷中應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的原因

１．在常規(guī)病理活檢中,通常有５～１０％的疑難病例不能明確診斷。

２．形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的腫瘤可為不同的組織來源（如未分化癌和惡性淋巴瘤)因而難于識(shí)別，給治療帶來困難。  

３．一些轉(zhuǎn)移性腫瘤常常缺乏特有的組織學(xué)特征，因而無法確定其原發(fā)病灶（如甲狀腺癌和前列腺癌)。 

４．通過一些反映細(xì)胞增殖和與腫瘤惡性程度有關(guān)的標(biāo)記物協(xié)助識(shí)別腫瘤的良惡性。

（二)各種不同組織及其腫瘤常見的標(biāo)記物

免疫組織化學(xué)最突出的優(yōu)點(diǎn)是能在微觀世界原位地確定組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，由于其方法簡便且可重復(fù)性強(qiáng)，目前已得到廣泛的應(yīng)用，并正繼續(xù)向著更微細(xì)、更精確的原位分子雜交和免疫電鏡方向發(fā)展，向著分子病理學(xué)的領(lǐng)域推進(jìn)。

表18-1 各種不同組織及其腫瘤常見標(biāo)記物

第三節(jié) 電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡（electron microsocope)簡稱電鏡，是以電子束為照明源，通過電子流對(duì)生物樣品的透射以及電磁透鏡的多級(jí)放大后的熒光屏上成像的大型精密儀器。按工作原理和用途的不同可分為透射式電鏡（transmission electronmicroscope, TEM)和掃描式電鏡（scanning electron microscope, SEM)二種基本類型。

一．透射式電鏡

主要用于觀察細(xì)胞內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu)，由于電子的穿透力較弱，故用于透射電鏡觀察的標(biāo)本必須切成50~100nm的超薄切片。換句話說，一個(gè)細(xì)胞要被切成100~200個(gè)薄片才適于在透射電鏡下觀察。樣品在被超薄切片之前，一般要經(jīng)過固定、脫水和包埋等處理，在切片之后還要經(jīng)過染色等處理才能進(jìn)行觀察。

超薄切片術(shù)（techniques of ultrathinsection)是最基本的電鏡樣品制備技術(shù)，其基本過程同石蠟切片大體相似，包括取材、固定、漂洗、脫水、滲透與聚合、切片和染色等多個(gè)環(huán)節(jié)，但操作過程比石蠟切片更為細(xì)致與復(fù)雜。為了獲得理想的超薄切片，操作者必須認(rèn)真對(duì)待每一步驟，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導(dǎo)致制樣的失敗。

合格的超薄切片樣品應(yīng)該達(dá)到以下基本要求：①切片的厚度應(yīng)在50nm左右，不能超過100nm，以獲得較高的分辨率和較高的反差；②切片應(yīng)能耐受電子束的強(qiáng)烈照射而不發(fā)生破裂、變形；③細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保持良好，沒有明顯的物質(zhì)凝聚和丟失。

電子顯微鏡技術(shù)使病理學(xué)對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)，從組織細(xì)胞的光鏡水平深入到細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)水平，它可觀察細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞骨架或大分子水平的變化，在疾病的病理診斷中，電鏡主要用于腎臟的細(xì)針穿刺活檢標(biāo)本，來進(jìn)行腎小球腎炎的分型。在腫瘤診斷中，電鏡在確定腫瘤細(xì)胞的組織發(fā)生、類型和分化程度上起著重要作用(圖18-6)�？筛鶕�(jù)各種腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來協(xié)助區(qū)別分化差的癌和肉瘤、各種梭形細(xì)胞惡性腫瘤、各種惡性小圓細(xì)胞腫瘤、各種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及惡性黑色素瘤等。其方法包括負(fù)染色技術(shù)、冷凍蝕刻技術(shù)、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡X射線顯微分析技術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)等在疾病的研究中已得到廣泛的應(yīng)用。

二．掃描電鏡

掃描電子顯微鏡就是用聚得很細(xì)的電子束流照射要檢測的樣品表面。由于電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種信息然后通過不同的檢測器接收相應(yīng)的信息，經(jīng)過處理后顯示出樣品的各種特征。

掃描電鏡具有以下特點(diǎn)：能夠直接觀察樣品的表面的結(jié)構(gòu)；樣品制備過程簡單，不用切成超薄切片；可以從各種角度對(duì)樣品進(jìn)行觀察；景深大，圖像富有立體感；圖像的放大范圍廣，分辨率也比較高(圖18-7)；電子束對(duì)樣品的損傷與污染程度較小；在觀察形貌的同時(shí)，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號(hào)作微區(qū)成分分析。

采用冷凍樹脂割斷法將細(xì)胞打開，可以觀察到細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。用鑄型技術(shù)研究空腔臟器，尤其是血管系統(tǒng)復(fù)雜的立體分布。還可用鹽酸化學(xué)消化法觀察細(xì)胞的基底面及深層細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。

第四節(jié) 共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)

共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanningmicroscopy)可以從組織細(xì)胞水平直接進(jìn)入亞細(xì)胞水平觀察，且可利用計(jì)算機(jī)及圖像處理系統(tǒng)對(duì)組織，細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行斷層掃描，三維立體空間結(jié)構(gòu)再現(xiàn)，將形態(tài)學(xué)研究從平面圖像水平提高到三維立體水平，圖像清晰鮮艷；還可在觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，直接顯示培養(yǎng)活體細(xì)胞內(nèi)的代謝變化(圖18-8)，可以說病理學(xué)及其它形態(tài)學(xué)研究將出現(xiàn)一個(gè)全新的時(shí)代。

圖18-8  共聚焦激光掃描圖

左 體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞；中 花粉顆粒三維圖像;右 神經(jīng)細(xì)胞DNA含量熒光強(qiáng)度圖

第五節(jié) 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)（biochip technique)是將大量具有生物識(shí)別功能的分子或生物樣品有序地點(diǎn)陣排列在支持物上并與標(biāo)記的檢體分子同時(shí)反應(yīng)或雜交，通過放射自顯影、熒光掃描、化學(xué)發(fā)光或酶標(biāo)顯示可獲得大量有用的生物信息的新技術(shù)。生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片�？蓪�(duì)DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織以及其它生物成分進(jìn)行高效快捷的測試和分析。

一、基因芯片

基因芯片(genechip)是指采用原位合成或顯微打印方法，將大量DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(圖18-9)。可自動(dòng)、快速地檢測出成千上萬個(gè)基因的表達(dá)情況，為基因診斷、藥物篩選以及新基因發(fā)現(xiàn)提供了有力的手段。    

圖18-9 cDNA基因芯片檢測mRNA表達(dá)

二、蛋白芯片

蛋白芯片技術(shù)的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光素的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到檢測多種蛋白質(zhì)及其功能的目的。如抗體芯片可排列數(shù)百種單克隆抗體，通過這張芯片，人們?cè)谝淮螌?shí)驗(yàn)中就能夠比較幾百種蛋白的表達(dá)變化。對(duì)于診斷疾病：如傳染病、腫瘤、遺傳病等臨床工作以及信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等基礎(chǔ)研究都具有廣泛的應(yīng)用前景

三、組織芯片

組織芯片又稱組織微列陣（tissue microarray) 是將數(shù)十個(gè) 數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)小的組織片整齊的排列在一起到載玻片上，形成微縮的組織切片(圖18-10)。

圖18-10  組織芯片

其特點(diǎn)有：①體積小信息含量高.可根據(jù)不同需要進(jìn)行組合和設(shè)計(jì)；②即可用于形態(tài)學(xué)觀察也可用于免疫組織化學(xué)染色。原位雜交, FISH 等原位組織細(xì)胞學(xué)觀察和研究；③高效快速,低消耗,自身內(nèi)對(duì)照和可比性強(qiáng),節(jié)時(shí)、省力、少材、高效利用庫存蠟塊腫瘤標(biāo)本的新方法。一個(gè)蠟塊可連續(xù)切片200張，以供原位分析腫瘤相關(guān)基因DNA及其表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)，熒光原位分子雜交（FISH)，mRNA原位雜交、免疫組化三種方法可同時(shí)在一個(gè)芯片蠟塊的連續(xù)組織切片中應(yīng)用。

因而可提高實(shí)驗(yàn)效率，一張組織芯片上可列陣數(shù)十至數(shù)百個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)條件最大程度上保持一致，有助于減少實(shí)驗(yàn)誤差。另外

一個(gè)組織芯片蠟塊可連續(xù)切200張片，可進(jìn)行許多分子標(biāo)記檢測。

最大限度地利用有限的標(biāo)本資源，尤其是少見的病例標(biāo)本，最小破損原有蠟塊。

可同時(shí)檢測一種腫瘤不同階段的基因表達(dá)狀況。能在一張片上同時(shí)看到一個(gè)腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移 、復(fù)發(fā)中的基因擴(kuò)增情況。

第六節(jié) 激光顯微切割技術(shù)

顯微切割（micro-desection)就是在顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細(xì)胞涂片上將所要研究的形態(tài)或表型相同的細(xì)胞從組織三維構(gòu)造中分離出來，獲得純的細(xì)胞群（pure cell population)，以備進(jìn)一步作分子水平的研究(圖18-11)。顯微切割技術(shù)的貢獻(xiàn)就是克服了組織的細(xì)胞成分非常繁雜這一重大的缺點(diǎn)。

一、顯微切割的方法

1．材料來源

微切割可用于福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片、冰凍切片、培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞涂片。但所用載玻片不準(zhǔn)涂抹任何粘附劑，常用的組織切片是HE染色的常規(guī)石蠟切片（厚5μm)。

2．切割及細(xì)胞采集方法

微切割及細(xì)胞采集方法大體上可分為手工操作和儀器操作兩大類。兩者各有長短。從兩個(gè)方面評(píng)價(jià)這些方法，一是準(zhǔn)確性，即有無雜細(xì)胞污染；二是它的效率，能否在較短時(shí)間內(nèi)采集到足夠的細(xì)胞；當(dāng)然也要考慮方法所需費(fèi)用。

（1)手工操作  就是用消毒的細(xì)針或刀片搔刮組織切片（厚5~15μm)上的細(xì)胞，并將其移至Eppendorf管中。

（2)儀器操作  利用激光進(jìn)行微切割和細(xì)胞采集，其特點(diǎn)是微切割的精度高，可進(jìn)行單個(gè)或幾個(gè)至數(shù)十個(gè)細(xì)胞的切割，可獲得很純的細(xì)胞群體，并適用于各種組織材料；再就是效率高，但儀器價(jià)格昂貴。具體又有4種不同的方法：①激光微光束微切割 ② 激光加壓彈射③貼于膜上的原組織微切割 ④激光俘獲微切割。

二、顯微切割的應(yīng)用

1．細(xì)胞基因突變及微衛(wèi)星變異的研究

2．細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化和甲基化水平的檢測

3．定量RT-PCR

4．比較基因組雜交

5．cDNA微陣列（芯片)

第七節(jié) 原位分子雜交技術(shù)

原位核酸分子雜交（in situ hybridization, ISH)是應(yīng)用特定標(biāo)記的已知核酸探針與組織或細(xì)胞中待測的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，雜交后的信號(hào)可以在光鏡或電鏡下進(jìn)行觀察。由于核酸分子雜交的特異性強(qiáng)、敏感性高、定位精確、并可半定量，因此該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的研究之中(圖18-12)。     圖18-12肺腺癌

  β-catmRNA的表達(dá)，原位雜交

第八節(jié) 熒光原位分子雜交染色體分析技術(shù)

一、簡介（introduction)

染色體原位分子雜交技術(shù)（Chromsome Analysis byFluorescence in situ Hybridization)的發(fā)展為研究染色體上DNA的序列提供了一個(gè)最直接的方法。具有經(jīng)濟(jì)、安全、快速、穩(wěn)定，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，多彩FISH可在同一核內(nèi)顯示兩種或多種序列，還可對(duì)間期核染色體進(jìn)行研究(圖18-13)；應(yīng)用不同的探針可顯示某一物種的全部基因，某一染色體染色片段及單拷貝序列；結(jié)合共焦激光顯微鏡可對(duì)間期核及染色體進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)研究，精確檢測雜交信號(hào)。

二、探針（probes)

1．基因組探針（genomic probe)：

人類基因組內(nèi)一些高頻率的重復(fù)序列，在進(jìn)化上很少具有保守性。若以基因組DNA作為探針，這些存在于探針和靶細(xì)胞順序中的高度重復(fù)序列之間會(huì)首先退火結(jié)合，越過那些保守的和單一的序列，故雜交會(huì)呈現(xiàn)出種特異性。利用這類探針在人鼠雜交細(xì)胞中可特異顯示人的遺傳物質(zhì)。

2．染色體特異性序列探針（probe recognizing chromosome specificsequences)：

目前在人幾乎所有染色體中已經(jīng)克隆出一些重復(fù)序列，重復(fù)一百到五千次不等，各具染色體特異性。大多在某一染色體的著絲粒區(qū)或異染色質(zhì)區(qū)產(chǎn)生致密的雜交帶。從而可特異性地識(shí)別某一染色體。

3．染色體文庫探針（chromosomelabraries probe)：

染色體文庫收集人類單條染色體的DNA作為探針，又稱整體染色體探針。單條染色體的獲得一般有兩種方法：來自僅攜有某一條人類染色體的體細(xì)胞雜交株，或經(jīng)流式細(xì)胞分類儀從染色體懸液中分離

4．單一序列探針（single-copysequences probe)： 

  FISH有一弱點(diǎn)，就是要求探針足夠大，探針越小，雜交位點(diǎn)檢出率就越低。欲利用FISH檢測存在基因組內(nèi)的單一序列基因，最有效的方法是應(yīng)用含大插入片段的克隆載體，如全Cosmids（載約40kb的插入片段)，更大的YAC載體（載100-800kb插入片段)。若掌握好，小到2kb的質(zhì)粒探針亦可用FISH方法定位，但效率較低。

三、FISH技術(shù)系列

1．24色mFISH核型分析技術(shù)

24色mFISH是近年建立的一種新技術(shù)。其原理是使用5種熒光染料按比例標(biāo)記探針，雜交后形成24條染色體各自呈現(xiàn)特異的熒光色彩以供核型分析(圖18-14)。為研究人員提供了更豐富詳盡的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，包括確定標(biāo)記染色體的來源、檢測微小的染色體易位和檢測復(fù)雜的染色體易位，尤其為腫瘤細(xì)胞染色體分析提供了全新、高效的方法 。

2．原位雜交顯帶技術(shù)(in situ hybridizationbanding,ISHB)

為了準(zhǔn)確定位原位雜交部位所處染色體及其區(qū)帶，染色體必須顯帶。但無論是先雜交后顯帶，還是先顯帶后雜交，雜交與顯帶過程會(huì)互相影響效果。后來人們注意到，人類短間隔插入重復(fù)序列中的一種Alu家族，Alu片段約300bp長，在基因組中重復(fù)約九十萬次，平均間隔3-4kb就插入一個(gè)。有人利用部分Alu序列作為引物，用PCR方法擴(kuò)增Alu之間的DNA，稱Alu-PCR法。但Alu序列在基因組內(nèi)分布不是隨機(jī)的，有些區(qū)域比較密集，有些區(qū)域較稀疏。只有前者才有PCR產(chǎn)物。人們用Alu-PCR產(chǎn)物作為探針與人類染色體標(biāo)本雜交，結(jié)果得到類似R帶的熒光帶型。故人們?cè)谶M(jìn)行基因定位時(shí)，只需將目的探針與Alu-PCR探針同時(shí)應(yīng)用，用不同顏色的熒光標(biāo)記，就可同時(shí)顯示雜交信號(hào)和染色體帶型。

3．FISH基因定位（FISH mapping)

基因定位時(shí)，不但需要確定某段靶序列在染色體上的位置，尚需確定兩個(gè)或兩個(gè)以上靶序列在線性DNA分子的排列次序和距離，才能繪出基因圖。一般用同位素雜交：先確定每一靶序列在中期染色體上的位置，然后根據(jù)它們到端粒的距離確定出線形排列次序。而用FISH方法，兩種或兩種以上的探針能同時(shí)與中期染色體雜交，只要根據(jù)兩種顏色雜交位點(diǎn)的相互位置，就能直接確定次序。但中期染色體是線形DNA分子經(jīng)過折疊和包裝后形成的，若兩個(gè)靶序列相距很近，例如間距小于1Mbp，受包裝過程的影響，它們?cè)诰�形DNA分子上的排列與在中期染色體上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，靶序列之間在間期核的平均相對(duì)距離與它們?cè)诰�形DNA分子上的距離呈正相關(guān)。利用間期核FISH分析不但能排除染色體包裝的影響，還能提高測距的分辨率(圖18-15)。

4.FISH的應(yīng)用

(1)基因定位與基因制圖（genemapping) 原理前面已敘述。FISH已經(jīng)極大地加速了人類基因定位和基因制圖的進(jìn)程。

(2)基因診斷(genediagnosis) 精確、直觀、明了

(3)間期細(xì)胞遺傳學(xué)（interphasecytogenetics)

(4)FISH在腫瘤生物學(xué)中的應(yīng)用 

①腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)（onco-cytogenetics)；②基因定位：FISH可用于分離出的癌基因與抑癌基因初步定位；③病毒基因插入基因組部分的檢測：雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒以激活原癌基因?yàn)橹鳎�也有像腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白產(chǎn)物與抑癌基因蛋白產(chǎn)物相互作用而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但病毒基因特別是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因組。利用FISH可以檢測到病毒整合到人基因組中的情況，對(duì)深入研究病毒致癌機(jī)理，以及檢測、防治腫瘤均具有重要意義；④基因的擴(kuò)增與缺失：原癌基因的激活與抑癌基因的失活是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。已知原癌基因的激活方式有：突變、基因擴(kuò)增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有：點(diǎn)突變、基因缺失。FISH為研究基因的擴(kuò)增和缺失提供了新的方法，能將基因擴(kuò)增和染色體重復(fù)分開。

第九節(jié) 比較基因組雜交技術(shù)

比較基因組雜交技術(shù)(comparative genomehybridization,CGH)。

圖18-16   食管癌細(xì)胞系CGH圖

其基本原理是用不同的熒光染料分別標(biāo)記正常人基因組DNA與腫瘤細(xì)胞DNA，然后與正常人中期染色體雜交，通過檢測染色體上兩種熒光（紅、綠)的相對(duì)強(qiáng)度比率，兩組DNA相異部分會(huì)顯出顏色偏移，可計(jì)算出DNA的缺失與放大，從而了解腫瘤組織DNA拷貝數(shù)的改變，并能同時(shí)在染色體上定位(圖18-16)。這樣的方法使我們只要從新鮮組織或石蠟包埋腫瘤組織中提取少量DNA，就可進(jìn)行全基因組檢測。應(yīng)用CGH技術(shù)檢測癌變過程中的不同階段，腫瘤進(jìn)展的不同時(shí)期及不同類型腫瘤的非隨機(jī)性染色體改變，有助于從分子細(xì)胞遺傳學(xué)角度了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對(duì)發(fā)現(xiàn)腫瘤遺傳學(xué)標(biāo)記，初步查尋腫瘤相關(guān)基因的位置均具有重要意義。其對(duì)檢測原癌基因擴(kuò)增較為靈敏，但對(duì)檢測基因缺失敏感性則相對(duì)較弱。

第十節(jié) 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM)是一種單細(xì)胞定量分析和分選的新技術(shù)，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞逐個(gè)地進(jìn)行高速準(zhǔn)確的定量分析和分類。

流式細(xì)胞儀的主要工作原理是讓熒光染色細(xì)胞在穩(wěn)定的液流推動(dòng)裝置作用下通過直徑為50~100m的小孔并排列成單行，每個(gè)細(xì)胞依次而且恒速通過激光束的照射區(qū)，細(xì)胞受激光照射后發(fā)生散射光和熒光。通過檢測散射光可知細(xì)胞的體積，檢測熒光可知細(xì)胞DNA或RNA的含量。細(xì)胞樣品被檢測后即形成一連串均勻的液滴，其形成速度約每秒3萬個(gè)，而細(xì)胞通過小孔（噴嘴)的速度在每秒2000個(gè)以下。由此計(jì)算，平均每15個(gè)液滴中有一個(gè)液滴包有細(xì)胞，而其它液滴無細(xì)胞。由于液滴中的細(xì)胞是已被測定的細(xì)胞，因而，如其特性與被選定要進(jìn)行分選的細(xì)胞特性相符，則儀器在含有這個(gè)細(xì)胞的液滴形成時(shí)就使其帶有特定的電荷；否則，液滴不帶電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時(shí)，依據(jù)自身所帶電荷性質(zhì)發(fā)生向左或向右偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中。不帶電荷的水滴就進(jìn)入中間廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選的目的。

因此流式細(xì)胞計(jì)可同時(shí)檢測單個(gè)細(xì)胞DNA、RNA、細(xì)胞體積等參數(shù)，進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的研究；并可分析細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的各種抗原、蛋白、酶、細(xì)胞因子和粘附分子以及基因表達(dá)產(chǎn)物；還可在無菌條件下，以高速對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行分類收集，其純度達(dá)90~99%。此外還可應(yīng)用于酶活性、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜受體、表面電荷、細(xì)胞內(nèi)pH、細(xì)胞和線粒體膜電位、細(xì)胞漿和膜結(jié)合的鈣離子、膜的完整性、流動(dòng)性、通透性或微粘度等功能研究。

第十一節(jié) 組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

組織與細(xì)胞培養(yǎng)(tissue and cell culture)是將活體內(nèi)部分組織細(xì)胞取出后在人工條件下使其生長，繁殖和傳代。在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)、細(xì)胞癌變等問題研究。還可施加實(shí)驗(yàn)因子進(jìn)行形態(tài)、生化、免疫、分子生物學(xué)觀察，已廣泛應(yīng)用于病理學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域。

原代培養(yǎng)：由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：離體時(shí)間短，遺傳性和體內(nèi)組織相似。宜作細(xì)胞形態(tài)、機(jī)能和分化研究。

傳代培養(yǎng)：把細(xì)胞自原代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中分離、稀釋而移至另一新的培養(yǎng)瓶中的操作程序即為傳代或再培養(yǎng)。以便持續(xù)培養(yǎng)，得到大量同種細(xì)胞，或建成細(xì)胞株，維持細(xì)胞種延續(xù)(圖18-17)。