實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的染色與形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察
一、細(xì)菌的染色檢查法
細(xì)菌體積微小、無(wú)色半透明，未經(jīng)染色不易觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)，需經(jīng)染色，顯微鏡放大后才能清晰可見(jiàn)。
染色方法有單染法和復(fù)染法兩種。單染法是使用一種染料使細(xì)菌著色，常用的有美藍(lán)和復(fù)紅染色；復(fù)染法用兩種或兩種以上的染料染色，有助于鑒別細(xì)菌，故又稱鑒別染色法。常用的復(fù)染法有革蘭染色法和抗酸染色法。
（一)細(xì)菌涂片的制作
要進(jìn)行細(xì)菌染色，首先需作涂片，細(xì)菌涂片的制作分涂片、干燥和固定三個(gè)步驟。
1．涂片：
(1) 取潔凈載玻片1張，在其中央加1滴生理鹽水。
(2) 將接種環(huán)燒灼滅菌，冷卻后自瓊脂斜面上取細(xì)菌少許，混于生理鹽水滴中，涂抹制成直徑約1cm大小的均勻懸液，然后將接種環(huán)滅菌。制作涂片時(shí)所取菌量不宜過(guò)多，以免涂抹不均使細(xì)菌聚集成團(tuán)，影響結(jié)果觀察。若取液體標(biāo)本(如肉湯培養(yǎng)物、膿液、痰液等)作涂片時(shí)，可不加生理鹽水而直接取標(biāo)本涂片。
(3) 接種環(huán)的滅菌和取菌法
滅菌：接種環(huán)在取菌前后，其金屬絲部分必須用火焰燒紅滅菌。方法是右手拿接種環(huán)。成45°角置火焰中，待金屬絲燒紅后，斜持接種環(huán)將金屬柄緩慢通過(guò)火焰滅菌。取菌后的接種環(huán)必須滅菌后才能置放實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。
取菌：用左手拇指與食指中指夾住瓊脂斜面管下端，斜面朝上，試管傾斜，用右手轉(zhuǎn)動(dòng)一下管口棉塞，在近火焰處用右手小指與掌面夾住棉塞并拔出，已拔出的棉塞不可放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，也不可觸及任何物品。試管口用火焰滅菌后，用已滅菌并冷卻的接種環(huán)伸入培養(yǎng)管中，自斜面上輕輕刮取細(xì)菌，取菌后將試管口再次滅菌，塞好棉塞放回原處。
2．干燥：涂片放室溫自然干燥，或?qū)?biāo)本涂抹面向上，在離火焰半尺高處微微烘干。切忌直接放在火焰上烤干。
3．固定：常用加熱固定法。其目的是殺死細(xì)菌，使菌體與玻片粘附牢固，在染色時(shí)不致被染液和水沖掉。手執(zhí)玻片的一端，標(biāo)本面朝上，來(lái)回通過(guò)火焰3次，注意溫度不可太高，以玻片反面觸及皮膚，感覺(jué)微燙為宜。
（二)革蘭染色法
【原理】
革蘭染色法是最常用的細(xì)菌鑒別染色法。同時(shí)還為分析細(xì)菌的致病性和選用抗菌藥物提供了依據(jù)。
革蘭染色的原理，主要是由于兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭陰性菌細(xì)胞壁中含有較多類脂質(zhì)，而肽聚糖含量較少。當(dāng)用酒精脫色時(shí)，溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，細(xì)胞脫色，經(jīng)復(fù)染后，染上復(fù)染液(復(fù)紅)的顏色；而革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量多且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)酒精脫色后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，酒精不易進(jìn)入菌體脫色，故細(xì)胞仍保留初染液(結(jié)晶紫)的顏色。
【材料】
1．葡萄球菌和大腸桿菌18～24h混合培養(yǎng)物。
2．革蘭染色液。
【方www.med126.com法】
1．制作細(xì)菌涂片、干燥、固定。
2．初染：涂片上加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，染色lmin，用水沖去染液，甩干。
3．媒染：加盧戈氏碘液數(shù)滴，1min后水洗，甩干。
4．脫色：加95%酒精，頻頻搖動(dòng)玻片，直到不再溶下染料為止，約30s，水洗，甩干。
5．復(fù)染：加1%復(fù)紅染液1min，水洗，甩干。
6．用毛坯紙或?yàn)V紙輕gydjdsj.org.cn輕印干，待標(biāo)本充分干燥后用油鏡觀察。
【結(jié)果】
葡萄球菌經(jīng)染色后呈紫色，為革蘭陽(yáng)性球菌；大腸桿菌染成紅色，為革蘭陰性桿菌。
【注意事項(xiàng)】
1．要掌握好染色的時(shí)間，尤其是酒精脫色時(shí)間，不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短。
2．選用18～24h培養(yǎng)物為宜，否則影響染色效果。
（三)抗酸染色法
見(jiàn)結(jié)核分枝桿菌。
二、活菌運(yùn)動(dòng)的觀察
【原理】
許多桿菌與弧菌有鞭毛，具有動(dòng)力，運(yùn)動(dòng)活潑。直接觀察細(xì)菌動(dòng)力是鑒別細(xì)菌的方法之一，常采用壓片法或懸滴法。
【材料】
1．變形桿菌、葡萄球菌肉湯12h培養(yǎng)物。
2．玻片、凹玻片、蓋玻片、凡士林、接種環(huán)、酒精燈等。
【方法】
1．壓片法 用接種環(huán)分別取變形桿菌及葡萄球菌菌液置于潔凈的玻片中央，在菌液上輕覆以蓋玻片(注意勿產(chǎn)生氣泡，也勿使菌液外逸) (圖2-1)，靜置片刻后于高倍鏡下觀察。
圖2-1 壓片法 觀察細(xì)菌動(dòng)力
2．懸滴法 在凹玻片的凹窩四周涂少許凡士林，用接種環(huán)分別取變形桿菌及葡萄球菌菌液置于潔凈的蓋玻片中央，將凹玻片的凹窩對(duì)準(zhǔn)蓋玻片的菌液處，反扣覆在蓋玻片上，微壓使二者貼緊后迅速反轉(zhuǎn)，使菌液懸滴于蓋玻片下(圖2-2)，靜置片刻后于高倍鏡下觀察。
圖2-2 懸滴法鏡檢操作步驟
【結(jié)果】
變形桿菌有明顯的定向運(yùn)動(dòng)，而葡萄球菌沒(méi)有定向運(yùn)動(dòng)。
【注意事項(xiàng)】
1．鏡檢時(shí)需適當(dāng)降低聚光器或縮小光圈，視野不宜過(guò)亮。
2．需仔細(xì)辨認(rèn)鞭毛的運(yùn)動(dòng)與布朗分子運(yùn)動(dòng)的不同，前者是有方向的位移，而后者則是細(xì)菌受環(huán)境中液體分子的沖擊呈現(xiàn)在原位附近的顫動(dòng)。
三、細(xì)菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)的觀察
（一) 細(xì)菌的基本形態(tài)(圖2-3)
圖2-3 細(xì)菌的基本形態(tài)
1．球菌：葡萄球菌(呈葡萄狀排列)、鏈球菌(呈鏈狀排列)、腦膜炎奈瑟菌(成雙排列)。
2．桿菌：大腸桿菌、枯草桿菌。
3．螺形菌：霍亂弧菌。
（二)細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)
圖2-4 細(xì)菌芽胞形態(tài)的示意圖
破傷風(fēng)梭菌具有芽胞，用革蘭染色法染色，可見(jiàn)破傷風(fēng)梭菌為革蘭陽(yáng)性桿菌，菌體末端有一個(gè)圓形未著色的芽胞，整個(gè)細(xì)菌呈鼓槌狀。
2．莢膜：觀察肺炎鏈球菌莢膜(Hiss染色法)。
具有莢膜的肺炎鏈球菌用Hiss染色法染色后，可見(jiàn)菌體呈藍(lán)色，莢膜不著色(圖2-5)。
圖2-5 肺炎鏈球菌莢膜形態(tài)圖2-6 細(xì)菌鞭毛的數(shù)目及排列
3．鞭毛(圖2-6)：觀察變形桿菌鞭毛。
變形桿菌經(jīng)鞭毛染色法染色后，可見(jiàn)菌體周圍有纖細(xì)的鞭毛。
