（四)藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法
1．巰基化藻紅蛋白（phycoerthrin PE)的制備，600μl的15.5mg/ml鹽酸巰醇亞胺（iminothiolane hydrochloride)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB、pH6.8 混合，裝入透析袋置入50mmol/l pH6.8 PB中透析，4℃過夜，再換用pH7.5PB透析6h。每個(gè)PE分子中可結(jié)合8個(gè)巰基。
2．PE-IgG制備 異雙功能試劑SPDP[n - Succ - inimdyl 3-(2-pyridyldlthio) propinate ] 30μl (1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50mmol/l pH7.5)，在室溫中反應(yīng)2.5h。再加入巰基化Pe 400μl（1.7mg/ml)加到500μl反應(yīng)混合液中，室溫反應(yīng)12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，用PB透析過夜，4℃。加入0.01%Na3N3分裝，4℃保存半年。
（五)PE-標(biāo)記蛋白A方法
�。�1)取4.08mg PE溶于0.1mol/l pH7.4PB（含0.1mol/l NaCl)1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP無水甲醇液（2.65mg/ml),SPDP/蛋白摩爾比為10，22℃反應(yīng)5min，過Sephadex G-50(1×17cm),用100mmol/l pH7.4 PBS（含0.1mol/l NaCl)平衡和洗脫。
�。�2)0.5ml蛋白（2mg/ml)100mmol/l PB(含有100mmol/l NaCl) pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白=9.5,22℃,40min ,加入25μmol/L二硫蘇糖醇（DTT)pH7.4緩沖液，22℃，25min，同上過Sephadex G-50，收集蛋白A峰。
�。�3)取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反應(yīng)6h，混合物4℃保存?zhèn)溆谩?/P>
以上兩種PE標(biāo)記制品，可最后溶于0.01mol/l pH7.4PB(含有0.1mol/l DETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA 和0.1%NaN3),0～5℃保存。
�。�)藍(lán)色熒光素標(biāo)記抗體方法
Kbaffan等（1986)首先創(chuàng)立了藍(lán)色熒光素標(biāo)記和染色技術(shù)，可進(jìn)行雙標(biāo)記或多標(biāo)記。
�。�1)取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC)260μg溶于二甲亞砜25μl中。
（2)將上液加入10ml IgG的 巴比妥緩沖液（0.5mol/L,pH8.5,內(nèi)含50～100mg IgG)中，室溫反應(yīng)2h，過Sephadex G-50除去游離熒光素。
AMC呈黃色結(jié)晶固體，最大吸收波長354nm,最大熒光波長430nm。
三、熒光抗體質(zhì)量控制
對制備的熒光抗體必須進(jìn)行質(zhì)量鑒定，主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個(gè)方面的鑒定。
�。ㄒ�)染色特異性和敏感性的測定
1．特異性染色效價(jià)的測定 直接染色以倍比稀釋熒光抗體溶液如1：2，1：4，1：8……，與相應(yīng)抗原標(biāo)本作一系列染色，熒光強(qiáng)度在“+++”的最大釋釋度，即為該熒光抗體的染色滴度（效價(jià))或單位。實(shí)際染色應(yīng)用時(shí)，可取低一個(gè)或兩個(gè)稀釋度（即2～4個(gè)單位)，如染色效價(jià)為1：64，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可取1：32或1：16。間接染色效價(jià)可按抗核抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強(qiáng)度“++”為標(biāo)準(zhǔn)，染色用效價(jià)和直接法相同。
2．非特異性染色測定 根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，結(jié)果在標(biāo)本上出現(xiàn)的非特異染色應(yīng)顯著低于特異染色滴度，否則應(yīng)采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體。
3．吸收試驗(yàn) 在熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4℃中過夜，3000r/min,離心30min，收集上清液，再用以染相應(yīng)抗原陽性標(biāo)本，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽性熒光。
4．抑制試驗(yàn)如前述。
�。ǘ�)F/P比值的測定
F（熒光素)和P（抗體蛋白)的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為1～2。過高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng)；過低時(shí)，熒光很弱，降低敏感性。
1．蛋白質(zhì)定量 測定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。
2．結(jié)合熒光素定量 先制作熒光素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即準(zhǔn)確稱取FITC1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀釋到100ml，此時(shí)熒光素含量為10 μg/ml，以此為原液，再倍比稀釋9個(gè)不同濃度的溶液，用分光光度計(jì)在490nm波長測定光密度值（OD)，以光密度為縱坐標(biāo)，熒光素含量為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)圖。醫(yī)學(xué) 全在.線提供www.med126.com
熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長波方向位移約5nm,FITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93～495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。
F/P比值的計(jì)算：可按以下公式計(jì)算。
式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103，而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。
測定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下：
按圖3-4測定法更為簡便，即先用276nm波長測得蛋白質(zhì)的OD值，再用493波長測得FITC的OD值，將這兩個(gè)OD值在圖3-14上連成一直線，直線與各縱線交叉處，即可查出標(biāo)記抗體的以下數(shù)值：FITc μg/ml ，F(xiàn)/P 的μg/mg,F/P的克分子比值，蛋白mg/ml等。
圖3-14 FITC標(biāo)記物中球蛋白、熒光色素和E/P比值計(jì)算圖
四、熒光抗體的保存
以0～4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性。最好加入濃度為1：5000～10000的硫柳汞或1：1000～5000的疊氮鈉防腐，小量分裝如0.1～1ml，真空干燥后更易長期保存。
