（三)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC)
它是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定。其最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對(duì)比清晰（圖3-9)，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同TITC。它可用于雙標(biāo)記示蹤研究�；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如下（圖3-10)。
圖3-9 TMRITC在可見(jiàn)光區(qū)的吸收
光譜和發(fā)射光譜
圖3-10 TMRITC結(jié)構(gòu)式
二、熒光素標(biāo)記抗體的方法
（一)FITC標(biāo)記抗體的方法
1．Marsshall 氏法
�。�1)材料：抗體球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸鹽緩沖液、無(wú)菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（25～50ml)、冰及冰槽（或1000ml燒杯)、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500ml)、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。
�。�2)方法及步驟：
�、倏贵w的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5～10min。
�、跓晒馑氐臏�(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg 熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。
�、劢Y(jié)合（或稱標(biāo)記)：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完)，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時(shí)添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫(kù)中。
④透析：結(jié)合完畢后，將球蛋白的溶液離心（2500r/min)20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4℃)過(guò)夜。
⑤過(guò)柱：取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，過(guò)葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定（圖3-11，圖-3-12)。
圖3-11 Sephadex G-25 對(duì)FITC
圖3-12 FITC與家兔IgG球蛋白在25℃和2℃時(shí)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)（Kawamura 1964)
洗脫液：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2);過(guò)濾量:12ml標(biāo)記全球蛋白液(過(guò)濾前未透析);收集量:20ml(稀釋1.7倍)。
分別以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸鹽緩沖液（分別為pH9.5和pH9.0)，于2℃下攪拌將其各加入100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻后立即將每份分為兩半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。間隔一定時(shí)間后各取出0.5ml通過(guò)sephadex G-25去游離FITC，由上計(jì)算出5mg家兔IgG結(jié)合的FITC量。
