�。ǘ�)基本操作步驟
組織處理及預(yù)雜交等步驟與本章 中敘述的放射性同位素標記cRNA探針相同，但由于地高辛標記cRNA探針在原位雜交細胞化學中已愈來愈得到廣泛的應(yīng)用，我們在基本方法中仍較詳細的敘述其操作過程。
1．組織前處理在組織制片中以冷凍切片（厚10～30μm)最佳。切片貼在預(yù)先清潔，高溫處理并涂以粘附劑載玻片上，先在37℃預(yù)干燥4h，然后置于37℃烤箱中過夜。經(jīng)過上述處理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存數(shù)月之久，有報告可保存數(shù)年之久的。但仍以新鮮制片為好。如為石蠟包埋切片，應(yīng)脫蠟經(jīng)梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在細胞內(nèi)mRNA含量高時應(yīng)用二甲苯脫蠟后仍能顯示。經(jīng)水洗后入37℃烤箱4h或過夜，然后進行雜交前處理。
在烘烤及低溫保存時，為防塵埃及空氣中RNA酶的污染，宜用錫箔紙（foilpaper)包被，內(nèi)加少許干燥劑（變色硅膠)。
下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
（1)PBS洗2×3min。
�。�2)選擇少數(shù)幾張切片作為“RNA酶對照片”。
其它切片暫放于PBs 內(nèi)。
RNA酶對照片處理方法：加RNA酶（100μg/ml)在預(yù)熱37℃的溶液內(nèi)。放在潮濕的盛有少許2×SSC塑料盒或蒸發(fā)皿內(nèi)。在每張切片上覆以過量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC沖洗，2×3min，然后與其它保存在PBS的切片一起進行下列處理。
�。�3)蛋白酶K消化：將組織切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，內(nèi)含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化時間應(yīng)根據(jù)組織的種類，厚度反復(fù)試驗調(diào)整。時間過短探針不易進入，過長影響細胞或組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
�。�4)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min終止蛋白激酶K反應(yīng)。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
�。�5)在4%多聚甲醛/PBS3min。
�。�6)以PBs 漂洗2×3min。
�。�7)浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制)10min，以封閉非特異性結(jié)合部位。
（8)2×SSC漂洗15min。
2．雜交以含cRNA探針（0.5ng/ml)的雜交液，按每張切片10～2μl的量覆蓋切片。地高辛配基標記的cRNA核酸探針保存濃度為2.5ng/ml，用前稀釋備用。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)ぃ糜谑⒂猩倭?×SSC溫盒內(nèi)在42℃，16～18h或過夜。
3．顯示
�。�1)用緩沖液1沖洗雜交后的載片2×3min。
�。�2)在緩沖液1中10min，室溫以封閉非特異性結(jié)合部位。
�。�3)拭干切片周圍的載片，注意保持切片濕潤。加數(shù)滴抗地高辛抗血清（工作濃度1：500，以緩沖液1稀釋)，孵育2h，室溫。
�。�4)緩沖液1漂洗3×3min。
�。�5)浸入緩沖液210min室溫。
�。�6)浸入底物中孵育10～30min（或更長時間，視需要而定)，底物內(nèi)含顯色BCIP/NBT，室溫。最好用錫箔紙包裹反應(yīng)盒，使顯色在黑暗中進行。定期取出切片在顯微鏡下檢測反應(yīng)強度。根據(jù)反應(yīng)強度決定延長或終止反應(yīng)。反應(yīng)顏色為紫藍色。
�。�7)將切片浸入緩沖液3以終止反應(yīng)。
�。�8)復(fù)染，可用1%伊紅、1%蘇木精、1%亮綠或5%的焦寧（又稱派咯寧丫)（pyronin 丫)10～30s。
�。�9)流水洗5～10min，直至水無色為止。
�。�10)在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在蓋片四周封固。為去除水份，在封固前可進行梯度酒精脫水，透明，DPX封固，但每步時間僅需幾秒鐘，時間過長易致褪色。
幾點說明
�、倬彌_液1，2，3配制法見附錄。緩沖液1中BSA用量大，價貴，如無法負擔可略去。
�、谇衅幚磉^程可采取漂浮法或載片染色法，載片染色適用于切片數(shù)數(shù)量較少時，可用液體覆蓋于切片表面進行孵育，漂洗在燒杯內(nèi)進行。如切片多，可將載片置于方形的染色缸（staining jar)內(nèi)，將沖洗液加入缸內(nèi)，如有振蕩器在漂洗中稍加震蕩更有助于減低背景染色。漂浮法適用于切片數(shù)量大量，將切片置于凹形碟內(nèi)，或染色缸內(nèi)。漂浮法的優(yōu)點是節(jié) 約試劑用量，切片兩面均可接觸反應(yīng)液，有利于信號的增強。
�、墼诘孜镏蟹跤龝r間過長會產(chǎn)生弱強的非特異性染色，有時甚至誤為陽性反應(yīng)。解決方法一是設(shè)置對照片，二是對非特異性染色加以區(qū)別。非特異性染色與特異性染色的主要區(qū)別點在于后者有結(jié)構(gòu)性定位，而前者系無結(jié)構(gòu)性定位，常在切片邊緣或細胞密集處呈現(xiàn)較強的顏色反應(yīng)。
�、茉诮M織前處理中應(yīng)嚴格注意控制RNA酶的污染，包括戴手套、器皿消毒等。另外，和免疫細胞化學一樣，自始至終應(yīng)保持切片的濕潤，勿令其干燥。
