基因工程的基本技術(shù)是人工進(jìn)行基因的剪切、拼接、組合。基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA線形分子片段準(zhǔn)確地切出來，需要各種限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease)；要把不同片段連接起來，需要DNA連接酶（ligase)；要結(jié)合基因或其中的一個(gè)片段，需要DNA酶（DNa polymerase)等。因此，酶是DNA重組技術(shù)中必不可少的工具，基因工程中所要用的酶統(tǒng)稱為工具酶。
一、DNA限制性內(nèi)切酶
Lurva和Human（1952)以及Bertani和Weigle（1953)發(fā)現(xiàn)了噬菌體λ的限制作用，即用一種λ噬菌體在一種宿主細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但在另一種宿主細(xì)胞中生長(zhǎng)很差，其原因在于它的DNA受到后一種宿主的“限制”。由此發(fā)現(xiàn)了限制-修飾系統(tǒng)。
各種細(xì)菌都能合成一種或幾種順序?qū)Ｒ坏暮怂醿?nèi)切酶。這些酶切割DNA的雙鏈，因?yàn)樗鼈兊墓δ芫褪乔懈頓NA，限制外源性DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，所以稱這種核酸內(nèi)切酶為限制酶。合成限制酶的細(xì)胞自身的DNA可以不受這種酶的作用，因?yàn)榧?xì)胞還合成了一種修飾酶，它改變了限制酶識(shí)別的DNA順序的結(jié)構(gòu)，使限制酶不能起作用。限制-修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。如果用噬菌體去感染限制-修飾系統(tǒng)有活性的細(xì)菌，噬菌體DNA沒有先經(jīng)修飾，它與先經(jīng)修飾的噬菌體相比，感染效率要低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。未經(jīng)修飾的噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)胞后被限制酶切成片段，片段的數(shù)目與DNA分子中限制酶的識(shí)別點(diǎn)數(shù)目成正比，這些片段進(jìn)一步被細(xì)胞的核酸外切酶降解，就會(huì)開始裂解感染，由此產(chǎn)生的子代噬菌體全部帶有修飾過的DNA，因此能以很高的效率去感染另一些具有相同限制-修飾系統(tǒng)的細(xì)菌。目前，從各種生物中分離出的限制性內(nèi)切酶已超過175種，其中80多種是切割DNA雙鏈。
�。ㄒ�)命名原則
限制性內(nèi)切酶主要是從原核生物中提取的。現(xiàn)在通用的命名原則是：第一個(gè)字是細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母，第二、三個(gè)字是細(xì)菌種名的前二個(gè)字母，這些字母都用斜體字母；接下去是細(xì)菌株的第一個(gè)字母，用正體字母書寫。如果同一菌株中有幾種不同的內(nèi)切酶時(shí)，則分別用羅馬數(shù)字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……來代表。現(xiàn)在列表舉例說明如下（表23-1)。
表23-1 幾種限制性內(nèi)切酶命名原則舉例
| 細(xì)菌原名 | 細(xì)菌種名 | 菌株名稱 | 限制酶名稱 |
| Arthrobacter | Luteus | AluⅠ | |
| Bacillus | amyloliquefaciens | H | BamHⅠ |
| Escherichia | Coli | RY13 | EcoRⅠ |
| Haemophilus | influeuzae | Rd | HindⅢ |
�。ǘ�)分類和特性
限制性內(nèi)切酶主要分成三大類。第一類限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中沒有多大用處，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。
第二類限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，并能構(gòu)建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。如果識(shí)別位置在DNA分子中分布是隨機(jī)的，則識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶每隔46（4096)個(gè)核苷酸就有一個(gè)切點(diǎn)。人的單倍體基因組據(jù)估計(jì)為3×199核苷酸，識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)將有（3×109/2.5×102)約107個(gè)切點(diǎn)，也就是可被這種酶切成107片段，識(shí)別6個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶也將有（3×109/4×103)約106個(gè)切點(diǎn)。醫(yī).學(xué).全.在.線.網(wǎng).站.提供
第二類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?/P>
↓ |
5’……GAA | TTC……3’
3’……CTT | AAG……5’
| ↑
垂直虛線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome)。實(shí)線剪頭表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個(gè)DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，可通過形成氫鍵而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如HaeⅢ的識(shí)別位置是：
↓
5’……GG↓CC……3’
3’……CC↓GG……’
↑
在箭頭所指處切割，產(chǎn)生的兩個(gè)DNA片段是：
5’……GG CC……3’
和
3’……CC GG……5’
有時(shí)候兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識(shí)別順序都是5’……GCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點(diǎn)的酶稱為同切酶或異源同工酶（isoschizomer)。
第三類限制性內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對(duì)于克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。
