1．基因轉(zhuǎn)移方法
�。�1)特異正�；虻姆蛛x與克�。簯�(yīng)用重組DNA和分子克隆技術(shù)結(jié)合基因定位研究成果，已有不少基因并將會有更多人類基因被分離和克隆，這是基因治療的前提，在當(dāng)代分子生物技術(shù)條件下，一般來說，只要有基因探針和準(zhǔn)確的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，現(xiàn)在既可人工合成DNA探針，還可用DNA合成儀在體外人工合成基因，這些都是在基因治療前，分離克隆特異基因的有利條件。
�。�2)外源基因的轉(zhuǎn)移：基因轉(zhuǎn)移（gene transfer)是將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)移方法較多，常用的要有下列幾類：
1)化學(xué)法：將正常基因DNA（及其拷貝)與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，直接傾入培養(yǎng)基中與細(xì)胞接觸，由于鈣離子有促進(jìn)DNA透過細(xì)胞有作用，某些化合物可擾亂細(xì)胞膜，故可將DNA輸入細(xì)胞內(nèi)，并整合于受體細(xì)胞的基因組中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整合基因得以表達(dá)，細(xì)胞亦可傳代。這種方法簡單，但效率極低，一般1000－100000個細(xì)胞中只有一個細(xì)胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。要達(dá)到治療目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細(xì)胞。當(dāng)然，可以通過選擇培養(yǎng)的方法來提高轉(zhuǎn)化率。
2)物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。
①電穿孔法：電穿孔法（electroporotion)是將細(xì)胞置于高壓脈沖電場中，通過電擊使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，但有時也會使細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。
�、陲@微注射法：顯微注射（microinjection)是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時。此法用于生殖細(xì)胞時，有效率可達(dá)10％。直接用于體細(xì)胞卻很困難。在動物實驗中，應(yīng)用這種方法將目的基因注入生殖細(xì)胞，使之表達(dá)而傳代，這樣的動物就稱為轉(zhuǎn)基因動物，目前成功使用得較多的是轉(zhuǎn)基因小鼠（transgenic mice)，它可作為繁殖大量后代的疾病動物模型。
�、壑|(zhì)體法：脂質(zhì)體（liposome)法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達(dá)。
3)同源重組法：同源重組（homologous recombination)是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝一Neo基因，則在同源重組后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin)的培養(yǎng)基中生長，從而使未插入新基因片段的細(xì)胞死亡。對于體細(xì)胞基因治療，體外培養(yǎng)細(xì)胞的時間不能過長，篩選量大，故在臨床上應(yīng)用也受限制難以進(jìn)行。今后如能改進(jìn)技術(shù)，提高重組率，這種定點修正基因的方法仍是有前景的。
4)病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：前述的化學(xué)和物理方法都是通過傳染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移（viral mediated gene transfer)是通過轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體（vector),將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運(yùn)載體（viral vector)。目前應(yīng)用的有兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
�、俜崔D(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。反轉(zhuǎn)錄病毒載體有以下的優(yōu)點首先是具有穿透細(xì)胞的能力，可使近100％的受體細(xì)胞被感染，轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率高；其次，它能感染廣譜動物物種和細(xì)胞類型而無嚴(yán)格的組織特異性；再者隨機(jī)整俁的病毒可長期存留，一般無害于細(xì)胞，但也存在缺點：這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細(xì)胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細(xì)胞，如神經(jīng)元。最嚴(yán)重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細(xì)胞感染病毒和致癌的危險性。因此，人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細(xì)胞的功能，試圖避免上述缺點。這種改造后的病毒稱為缺陷型病毒（defective virus)。這樣的病毒中的反轉(zhuǎn)錄酶可將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，有助于該DNA順利進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組，而該病毒則死亡。由于病毒整合基因組是隨機(jī)的，所以還是可能激活細(xì)胞的原癌基因，以及因隨機(jī)插入發(fā)生插入突變。
在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，最常用于人類的是莫洛尼（Mooney)鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV)，其人工構(gòu)建的結(jié)構(gòu)如圖14－1。
②DNA病毒介導(dǎo)載體（DNA viral mekiated vector)：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認(rèn)為這類病毒難于改造成缺陷型病毒，實用意義不大，但
圖14－1 Mo-MLV結(jié)構(gòu)示意圖
LTR：長末端重復(fù)序列，內(nèi)含啟動子、增強(qiáng)子及有關(guān)調(diào)節(jié)順序；gag：病毒核心抗原基因；
env：病毒外殼蛋白基因；pol：反轉(zhuǎn)錄酶基因
