中國(guó)幽門螺桿菌研究:幽門螺桿菌全菌抗原與尿素酶抗原ELISA血清學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用

大量研究資料證明，幽門螺桿菌（H.pylorgydjdsj.org.cn/kuaiji/i，Hp)是人類慢性胃炎和消化性潰瘍的重要致病菌且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。它可通過(guò)胃粘膜活檢組織尿素酶試驗(yàn)和Hp培養(yǎng)來(lái)診斷其感染，但病人必須接受胃鏡檢查，由于檢查時(shí)痛苦較大，更不易被復(fù)查和隨訪患者接受。Hp的尿素酶抗原可刺激機(jī)產(chǎn)生高滴度的循環(huán)抗體，其中IgG抗體滴度在未經(jīng)系統(tǒng)抗Hp治療的人群中，能確切地反映人體內(nèi)目前有無(wú)Hp感染，在感染病人經(jīng)抗Hp治療殺滅了體內(nèi)Hp3～6個(gè)月后，IgG抗體滴度能下降25％～50％，因此可客觀地反映治療效果。

1　材料和方法

1.1　血液標(biāo)本

血液標(biāo)本676例患者，平均年齡43.5歲（18歲～87歲)，主要癥狀為上腹痛及（或)食后上腹脹、惡心或嘔吐、燒灼感染、反酸、噯氣、食欲不振。少數(shù)病例經(jīng)胃鏡檢查，結(jié)果正常胃炎等器質(zhì)性病變。采取肘靜脈血2ml進(jìn)行檢測(cè)。

1.2　Hp尿素酶純化抗原的制備

①菌株選擇及細(xì)菌培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)選擇尿素酶活性高的Hp菌，接種含6％脫纖維羊血的布氏平皿中，置混合氣體（5％O₂、10％CO₂和85％N₂)環(huán)境中，37℃培養(yǎng)3d后收菌。②細(xì)菌破碎及預(yù)處理：將收集之Hp菌用生理鹽水洗2遍后，用凝膠過(guò)濾洗脫液將菌稀釋至15億菌/ml，用超聲波在冰浴中進(jìn)行破碎后，經(jīng)高速離心12000r/min，30min后取上清備用。③凝膠過(guò)濾用SephadesG200柱進(jìn)行，洗脫液測(cè)定尿素酶活性并將其活性峰與相應(yīng)菌全菌蛋白，上柱液及離心沉渣進(jìn)行SDS－PAGE分析，觀察尿素酶提純效果，Western blot分析是將尿素酶活性峰，經(jīng)SDS－PAGE將各蛋白分離后，經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，處理、染色照相，并記錄結(jié)果。

1.3　血清抗Hp尿素酶抗體的檢測(cè)

血清抗Hp尿素酶抗體的檢測(cè)：采用ELISA（按照Kesumen法改良)，檢測(cè)對(duì)象為門診受診的各類胃病患者共676例，經(jīng)純化尿素酶抗原包被的40孔（或96孔)酶標(biāo)板，用0.5％明膠0.1ml37℃作30min封閉，用洗滌液洗板三次，加入待檢血清并以特異性抗HpU抗體的含量為66μg/ml標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作為判斷村準(zhǔn)。加二抗HRP　SPA，用PBST20稀釋后，每孔加入0.1ml，37℃孵育30min，洗板3次后，在避光條件下與底物液中加入適量30％過(guò)氧化氫及鄰苯二胺，溶解后，每孔加入0.1ml，37℃孵育，顯色5min～10min，加2mol/LH₂SO₄終止液每孔0.1ml，用49nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度（A)[舊稱光密度（OD)，下同]（或目測(cè))。目測(cè)觀察：顏色淺于或等于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照者為陽(yáng)性，顏色深于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照者為陰性。儀器測(cè)定：以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（A)大于或等于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照者為陽(yáng)性，吸光度（A)小于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照者為陰性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)性對(duì)照吸光度（A)大于或等于0.2時(shí)，若陰性對(duì)照吸光度（A)小于0.1則試劑盒有效。ELISA特異性經(jīng)吸收試驗(yàn)鑒定，確定與空腸變曲菌（C.jejuni)、結(jié)腸變曲菌（C.coli)及海鷗變曲菌（C.laris)無(wú)交叉反應(yīng)。

2　結(jié)果

2.1　HpU抗原純化

應(yīng)用SephadesG200柱，從Hp超聲破碎物離心上清液中，一次性提純了Hp尿素酶抗原。SDS—PAGE分析結(jié)果表明，所提取的Hp尿素酶抗原中僅含有66KD及30KD兩種蛋白成分，與Hp尿素酶蛋白兩種亞基的大小完全相同，提取物中幾乎不含有其他雜蛋白成分，經(jīng)Western blot分析，證明所提純的Hp尿素酶抗原仍具有良好的抗原性。

為了檢測(cè)HpU純化抗原的敏感性與特異性，實(shí)驗(yàn)選擇經(jīng)Hp全菌蛋白抗原對(duì)人血清特異性抗Hp－IgG抗體檢測(cè)的陽(yáng)性及陰性各類胃�。�慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎等)患者血清各50份進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果用混合多型HpU純化抗原比全菌蛋白抗原為敏感，且特異性高（表1)。

表1　Hp全菌抗原與尿素酶純化抗原ELISA法檢測(cè)比較

X²＝6.38，P＞0.025

2.2　人血清特異性抗HpUIgG抗體的測(cè)定：用目測(cè)和酶標(biāo)儀測(cè)定胃病患者人群中血清抗HpUIgG抗體。按表2分析，以特異抗HpU抗體的含量為66μm/ml標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，ELISA法與免疫印跡分析對(duì)照，敏感性為98％，特異性為96％。

表2　676份病人血清抗幽門螺桿菌尿素酶抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

3　討論

Hp是人胃內(nèi)唯一產(chǎn)生高活性尿素酶的細(xì)菌，可通過(guò)檢測(cè)胃內(nèi)尿素酶的活性來(lái)診斷Hp感染，現(xiàn)已發(fā)展了多種檢測(cè)方法，如14N尿素酶排泄試驗(yàn)。¹³C或¹⁴C_—呼吸試驗(yàn)，均有較高的敏感性和特異性，但是以上幾種方法均需要特殊的檢驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)，不易在基層推廣和應(yīng)用，因此血清中Hp特異性抗體的檢測(cè)，在檢出與Hp相關(guān)性胃炎的診斷中尤為重要，與侵入性診斷方法或呼吸試驗(yàn)相比，血清學(xué)診斷易為患者接受，而ELISA法則更為常用，若用患者自身菌株作抗原較用標(biāo)準(zhǔn)菌株作抗原在ELISA試驗(yàn)中更能觀察到明顯的IgG滴度。

目前應(yīng)用于ILISA抗原有三類：①全細(xì)胞gydjdsj.org.cn/zhuyuan/抗原和超聲粉碎物抗原；②部分純化抗原；③高度純化抗原。Hp全菌細(xì)胞和未純化的細(xì)胞超聲波粉碎物抗原，用于Hp感染的血清學(xué)診斷一般特異性不高。用Hp多種抗原制品的混合物純化的純化尿素酶組分抗原，則可獲較高的特異性與敏感性。

實(shí)驗(yàn)采用ELISA法對(duì)676份人血清進(jìn)行了抗HpU抗體的檢測(cè)，以特異性抗HpU抗體的含量為66μg/ml標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性及特異性各為98％及96％。

對(duì)于Hp陽(yáng)性的慢性胃炎，抗菌治療是一種新的治療方法，我們已往研究表明慢性胃炎，尤其是活動(dòng)性胃炎與Hp感染更是密切相關(guān)，在抗菌治療前后用ELISA法檢測(cè)血清Hp抗體，抗菌治療后抗體滴度明顯下降，與Hp清除有關(guān)，炎癥程度減輕（活動(dòng)性胃炎癥消失)具有相關(guān)性。非潰瘍性消化不良（NUD)是常見的臨床癥候群，目前對(duì)其病因認(rèn)識(shí)尚不清楚，一般認(rèn)為是多樣性（heterogeneous)，其中慢性胃炎占很大比例，而與Hp感染密切相關(guān)，經(jīng)胃鏡胃粘膜活檢有半數(shù)以上有Hp存在，故認(rèn)為Hp在NUD病人中有一定致病作用。人群血清抗HpU抗體ILISA法檢查，屬于創(chuàng)傷檢測(cè)，可用作初篩檢查，以后隨訪，可免去病人多次胃鏡檢查之苦，節(jié)省不必要的檢查費(fèi)用，減少交叉感染機(jī)會(huì)，有較好的依從性（compliance)和可靠性。總之，用血清抗HpU抗體ELISA法檢測(cè)，對(duì)于慢性胃炎及非潰瘍性消化不良中Hp抗體的檢出，抗菌治療方案的確定，抗菌治療方案的隨訪與評(píng)價(jià)及流行病學(xué)調(diào)查研究，是一項(xiàng)簡(jiǎn)便、可靠、實(shí)用的方法。