消化道含有大量酶類，這些酶多由胃腸道粘膜中的相應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。用免疫細(xì)胞化學(xué)研究酶的分布及含量改變對(duì)某些消化道疾病的病因和診斷有較大價(jià)值。近年來，對(duì)溶菌酶的研究較多。以往的研究認(rèn)為溶菌酶是粒性白細(xì)胞所分泌。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和血清中含有溶菌酶。用免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)胃腸道某些腺體細(xì)胞也能分泌，且在不同病變中出現(xiàn)不同分泌特點(diǎn)。
1．組織固定和加工用冰凍組織切片可直接進(jìn)行溶菌酶免疫細(xì)胞化學(xué)研究。用冷酒精固定，4%福爾馬林緩沖液或1.5%戊二醛固定均能進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。但浸蠟時(shí)溫度不能超過60℃，載玻片應(yīng)涂薄層明膠以防組織切片脫落。載片后，組織切片應(yīng)放在50～56℃的烤箱中干燥但不能放在底層，因烤箱底層溫度不均勻。組織切片應(yīng)避免接觸含油類的手和容器。組織塊應(yīng)放在4℃密閉容器內(nèi)干燥保存。脫蠟一定要完全。
2．染色方法的選擇根據(jù)具備的抗體和標(biāo)記抗體，免疫熒光和免疫酶技術(shù)均可采用。間接法、PAP法和ABC等方法均可以選擇。大部分報(bào)道多采用冷凍切片和ABC染色方法。ABC方法特異性強(qiáng)，敏感性高，非特異性染色少。目前國(guó)內(nèi)已有ABC試劑盒生產(chǎn)。普遍認(rèn)為國(guó)外Vectastain 實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的Vectastain Elite ABC kit試劑盒較好，其敏感性比Vectastain ABC peroxidase kit高5倍。如果加大第一個(gè)抗體的濃度，可進(jìn)行快速染色，整個(gè)染色過程只需30min。如果要進(jìn)行雙標(biāo)記染色，可在DAB顯色液作用后組織切片再進(jìn)行另一種抗體染色，最后在DAB顯色液中加氯gydjdsj.org.cn/wsj/化鎳，使陽性部位顯示紫色。與DAB顯示紅棕色比較，反差明顯。
3．ABC染色步驟疊氮鈉能抑制過氧化酶活性，不宜用以稀釋ABC試劑盒中的試劑。第一抗體應(yīng)用0.1%結(jié)晶狀的牛血清白蛋白溶液稀釋。所用緩沖液最好新鮮配制，ABC試劑用玻璃瓶裝的蒸餾水稀釋，去離子水可能含過氧化酶抑制劑，能降低敏感性，不宜采用。具體步驟是：①新鮮組織冰凍切片后空氣干燥或風(fēng)干10min。②切片用丙酮或95%酒精固定10min后PBS沖洗3次，共10min。（也可先固定，后切片，再清洗)。③在0.3%H2O2甲醇中放置20min后PBS沖洗3次，每次5min。④用正常兔血清稀釋孵育20min后，用濾紙吸取過多的血清，并擦干載片中組織周圍的液體，但不能使組織干燥，并用彩色筆在組織周圍圈畫以防抗體液流失。⑤加鼠抗溶菌酶稀釋抗血清，在室溫下放置30min或在4℃過夜gydjdsj.org.cn后BPS洗10min。⑥加生物素化的兔抗鼠血清稀釋液，在室溫下放置30min后PBS洗20min。⑦加稀釋好的Vec-tastain Elite ABC試劑盒中的AB混合液（在使用前30min配好)，再孵育30min，PBS洗10min。⑧組織切片在含0.1%DAB（1mg/ml)和0.02%H2O2的0.1mol/l pH7.6 Tris緩沖液中反應(yīng)2～7min，自來水沖洗5min（在顯微鏡下觀察結(jié)果，決定反應(yīng)時(shí)間)后甲基綠或蘇木精對(duì)比染色，脫水和封片，顯微鏡觀察。
4．結(jié)果判斷溶菌酶主要分布在腺體細(xì)胞胞漿內(nèi)，其中以潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞中最明顯，也可以分布在腔面或粘液中。炎性組織中粒性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，也有明顯著色。但是這些細(xì)胞多位于固有層內(nèi)，即使個(gè)別細(xì)胞位于上皮層，其形態(tài)與腺體細(xì)胞不同，容易鑒別。當(dāng)然，這些陽性細(xì)胞需與內(nèi)源酶引起的著色相鑒別。
溶菌酶的主要功能是能溶解細(xì)菌表面的糖蛋白，具有抗感染的作用。也有人認(rèn)為能增加吞噬細(xì)胞作用，能與各種陰離子分子形成復(fù)合物。高濃度溶菌酶能改善細(xì)胞膜的功能。溶菌酶的研究包括組織中的分布和血清中含量測(cè)定。有人對(duì)不同病態(tài)胃粘膜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)除正常幽門腺細(xì)胞能合成溶菌酶外，其它胃腺體細(xì)胞均無此功能。表淺性胃炎時(shí)，胃體胃竇的頸粘液細(xì)胞開始具有分泌溶菌酶的功能。腸化生腺體中的潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、不典型增生的腺體細(xì)胞也能產(chǎn)生溶菌酶。作者推測(cè)可能慢性胃炎時(shí)細(xì)菌等感染機(jī)會(huì)增多，是機(jī)體局部產(chǎn)生的對(duì)感染的調(diào)節(jié) 反應(yīng)。有趣的是在胃癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)溶菌酶而且分化程度越高，分泌溶菌酶功能越強(qiáng)。轉(zhuǎn)移性胃癌細(xì)胞和胃腺瘤細(xì)胞增色能分泌溶菌酶。其機(jī)理還不清楚。
有人對(duì)腸道進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)正常小腸粘膜杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞能分泌溶菌酶，但含量較低。間質(zhì)內(nèi)粒性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也有溶菌酶。但是，正常結(jié)腸和直腸上皮細(xì)胞表面和粘液腺體隱窩細(xì)胞中沒有溶菌酶，固有層有溶菌酶陽性粒性白細(xì)胞。在15例潰瘍性結(jié)腸炎病人中7例在結(jié)腸的直腸上皮細(xì)胞胞漿出現(xiàn)溶菌酶，8例克隆氏病人中只有1例陽性。作者認(rèn)為用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行溶菌酶的定位研究有助于克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎病人的鑒別診斷。也有人對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)行研究，認(rèn)為溶菌酶的分布與胃癌相反，結(jié)腸癌分化越高，分泌功能越低、其機(jī)理尚不清楚。
血清溶菌酶濃度的測(cè)定也曾作為無并發(fā)癥的潰瘍性結(jié)腸炎和活動(dòng)性克隆氏病的鑒別診斷指標(biāo)之一。由于80%以上血清溶菌酶多來源于粒性白細(xì)胞，不論潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病都可能引起周圍血管局部粒性白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增多，因此，血清溶菌酶含量受到影響的因素較多，特異性不高，診斷價(jià)值有待進(jìn)一步研究。
