胃腸道（包括膽囊及肝外膽道)的植物性神經(jīng)分布有二個(gè)來(lái)源：①外源性神經(jīng)（extrinsic nerve)，指神經(jīng)來(lái)自胃腸道以外的其它部位。②內(nèi)源性神經(jīng)（intrinsic nerve)，指神經(jīng)來(lái)自胃腸及膽道壁內(nèi)的神經(jīng)叢。要應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)消化道內(nèi)源性神經(jīng)進(jìn)行研究，必須先了解消化管壁內(nèi)神經(jīng)叢的結(jié)構(gòu)。
內(nèi)源性神經(jīng)系指消化道的壁內(nèi)神經(jīng)叢。在胃腸道的壁內(nèi)神經(jīng)叢包括兩個(gè)主要的神經(jīng)叢：肌間神經(jīng)叢（Auerbach叢)和粘膜下叢（Meissner叢)。有的作者建議將粘膜下叢分為：最近腸粘膜肌面的Meissner叢，最近環(huán)肌內(nèi)表面的稱(chēng)Henel叢�，F(xiàn)較普遍采取的Furnes 和Cogydjdsj.org.cn/rencai/sta 的建議，將壁內(nèi)神經(jīng)叢分為粘膜叢、粘膜下叢、肌深叢、肌間神經(jīng)叢和漿膜下叢（圖13-1)。神經(jīng)節(jié) 主要位于肌間神經(jīng)叢和粘膜下叢。神經(jīng)叢由神經(jīng)節(jié) 和節(jié) 間連接來(lái)組成，節(jié) 間連接束連接散在分布、形狀不規(guī)則的神經(jīng)節(jié) ，組成圖案樣的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些神經(jīng)叢自食管下端的平滑肌部起，一直延伸到肛門(mén)的括約肌部，并與膽囊及肝外膽道的壁內(nèi)神經(jīng)叢相互連接，形成一個(gè)局部的神經(jīng)系統(tǒng)。因此，早在19世界初期，Langley就建議將胃腸道這個(gè)局部的神經(jīng)系統(tǒng)命名為腸道神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous sys－tem)，并建議作為植物性神經(jīng)系統(tǒng)中的，與交感和副交感神經(jīng)系統(tǒng)并列的第三個(gè)部分。隨著近代組織學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量實(shí)驗(yàn)資料證明，腸道神經(jīng)系統(tǒng)的獨(dú)特性，組織連接的復(fù)雜性和神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型的多樣性，確實(shí)不同于其它兩部分植物神經(jīng)系統(tǒng)。
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圖13-1 腸道神經(jīng)叢分布模式圖
（一)神經(jīng)叢的模式
在胃腸道及膽道的分層鋪片，用鍍銀、甲基藍(lán)、乙酰膽堿脂酶（Ache )和菸堿腺嘌呤雙核苷酸黃遞酶（Nicotinamide adenine dinucleotidediaphorase , NADH)染色法，可以見(jiàn)到壁內(nèi)神經(jīng)叢的全貌。由于胃腸道各段神經(jīng)節(jié) 的大小、形態(tài)不同，節(jié) 間連接束的粗細(xì)和長(zhǎng)短的不同，神經(jīng)叢的模式因胃腸道的不同部位、動(dòng)物的種屬不同而異。甚至在同一腸段，如結(jié)腸近腹膜附著方向，神經(jīng)叢的分布遠(yuǎn)離腹膜附著的方向密集。胃小彎部神經(jīng)叢的分布密集，神經(jīng)節(jié) 較大，而胃大亦部神經(jīng)的分布極少或無(wú)，胃腸道的粘膜下叢的神經(jīng)節(jié) 小，分布較較稀疏，與膽道的神經(jīng)叢相似。
（二)神經(jīng)元的數(shù)目和大小
胃腸道各段的神經(jīng)細(xì)胞密度（每平方厘米胃腸道壁所含的神經(jīng)細(xì)胞數(shù))也有不同，雖因染色方法和腸道擴(kuò)張度的不同，各家報(bào)告數(shù)字略有不同。一般神經(jīng)細(xì)胞的密度似與胃腸道肌層厚度有關(guān)。肌層愈厚，神經(jīng)細(xì)胞密度愈高。在哺乳類(lèi)動(dòng)物，結(jié)腸的神經(jīng)細(xì)胞密度較小腸高。動(dòng)物愈大，神經(jīng)節(jié) 分布愈稀疏，單位面積內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞也愈低。在出生后的發(fā)育過(guò)程中，肌間神經(jīng)叢內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增加。新生大鼠小腸神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)為420000，至成年時(shí)增為1850000。而在小腸的單位面積內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)，在新生小鼠為64345個(gè)/cm2，在成年僅為9405個(gè)/cm2。換而言之，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的增長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于腸道肌層的發(fā)育。至于出生后神經(jīng)叢內(nèi)新生神經(jīng)細(xì)胞的來(lái)源，是通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞的分裂或其它細(xì)胞的分化還是一個(gè)有待探索的問(wèn)題。
與其它植物性神經(jīng)節(jié) 相比，壁內(nèi)神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞大小的變異較為明顯。肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞大小的變異較粘膜下叢更為明顯，如在大鼠盲腸的神經(jīng)叢內(nèi)，神經(jīng)細(xì)胞的表面積為100～200μm2。小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)的小神經(jīng)細(xì)胞明顯多于大神經(jīng)細(xì)胞，而在胃腸道其它各段，則以大神經(jīng)細(xì)胞居多。神經(jīng)細(xì)胞大小的變異是否代表不同功能的神經(jīng)細(xì)胞亞群，尚不清楚。
（三)神經(jīng)細(xì)胞的類(lèi)型
依形態(tài)學(xué)分類(lèi)：Dogiel建議將腸道神經(jīng)元分為三種類(lèi)型：
1、I型具有許多短的、不規(guī)則的樹(shù)突和一根細(xì)而長(zhǎng)的軸突。
2、II型有一個(gè)短而局限于節(jié) 內(nèi)軸突和許多長(zhǎng)的延伸到神經(jīng)節(jié) 外的樹(shù)突。
3、III型具有中等長(zhǎng)短的樹(shù)突，終止于同一或鄰近的神經(jīng)節(jié) 。
Dogiel認(rèn)為I型屬運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，II型屬感覺(jué)神經(jīng)元。腸道神經(jīng)節(jié) 內(nèi)存在dogiel I型和II型細(xì)胞，還存在其它的中間型細(xì)胞，如在貓的粘膜下神經(jīng)叢中，單極和雙極的神經(jīng)細(xì)胞占83%，多極的神經(jīng)細(xì)胞占17%。這說(shuō)明腸道神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的多樣性。然而對(duì)于其形態(tài)與功能的相關(guān)性，是否I型與II型分別代表感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，多數(shù)學(xué)者持懷疑態(tài)度。
依所含化學(xué)物質(zhì)分類(lèi)：可分為含乙酰膽堿神經(jīng)細(xì)胞、含胺神經(jīng)細(xì)胞、含嘌呤核苷酸神經(jīng)細(xì)胞和含多肽神經(jīng)細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是顯示含多肽神經(jīng)細(xì)胞的有力工具�，F(xiàn)已知在消化管壁內(nèi)神經(jīng)叢內(nèi)含有血管活性腸肽、生長(zhǎng)抑素、物質(zhì)P和腦啡肽等多肽。用雙重免疫染色法可證明一種以上的多肽共存于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)。
用消化道切片結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色固然能顯示壁內(nèi)神經(jīng)叢的神經(jīng)細(xì)胞及gydjdsj.org.cn/shouyi/纖維。但由于壁內(nèi)神經(jīng)叢為扁平的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，欲窺其全貌，則以消化道全層鋪片技術(shù)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色效果最佳。消化道全層鋪片在英文文獻(xiàn)中通常稱(chēng)為whole mount stretch preparation，即整裝撕片。即根據(jù)消化管壁內(nèi)神經(jīng)叢的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分縱層肌、環(huán)層肌、粘膜下層等分層撕開(kāi)鋪片，以暴露不同的壁內(nèi)神經(jīng)叢。以腸道為例，簡(jiǎn)述消化道的分層鋪片技術(shù)。
動(dòng)物麻醉后，用Zamboin’s液行主動(dòng)脈灌注固定，剖腹取任何一段腸管放入上述固定液中4℃下3h，然后移至4%多聚甲醛液固定3h，再移至20%蔗糖4℃過(guò)夜，于次日行全層鋪片。選擇一大小適宜的吸管或玻棒穿入腸管，使其被動(dòng)擴(kuò)張，然后用鐘表鑷在腸系膜附著處沿腸管縱軸劃痕，用鑷尖沿劃痕輕輕剝離分離縱肌層，將剝離的縱肌層放在載玻片上（漿膜面向下)。在解剖顯微鏡下，用鑷尖輕挑去附于神經(jīng)叢上的環(huán)層肌，即得縱、環(huán)肌之間的肌間神經(jīng)叢。再將腸管的粘膜面向外翻套在吸管或玻棒上，用鑷子或手術(shù)刀反復(fù)刮去表面的上皮層，即可獲固有層表面的粘膜叢，重刮時(shí)刮去表面的粘膜層，即可暴露粘膜下層的粘膜下神經(jīng)叢。
撕片放入0.1mmol/L的PBS溶液中，等待進(jìn)行免疫染色。其步驟與切片染色同，只是由于撕片較厚，為增強(qiáng)抗體的穿透性，常于染色前在系列酒精中反復(fù)脫水后，再進(jìn)行免疫染色。一般撕片進(jìn)行免疫染色地漂浮法為佳，可增加壁內(nèi)神經(jīng)叢與抗血清的接觸。如撕片數(shù)量少，為節(jié) 約抗血清也可用載片法，此時(shí)載玻片上需涂抹一層粘附劑如鉻礬明膠或多聚賴(lài)氨酸，以免撕片在染色過(guò)程中脫落。
