脫落細(xì)胞檢驗(yàn)醫(yī)生除要熟練掌握細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)外，還必須掌握各項(xiàng)操作和染色技術(shù)及觀察方法，所以脫落細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)是重要的學(xué)習(xí)內(nèi)容之一。它包括標(biāo)本采集、制片、固定和染色、鏡下觀察方法及診斷要領(lǐng)等。
正確地采集標(biāo)本是細(xì)胞學(xué)診斷的基礎(chǔ)和關(guān)鍵之一，故要準(zhǔn)確地選擇部位，盡可能在病變區(qū)直接采集細(xì)胞。采集的標(biāo)本必須保持新鮮，盡快制得，以免細(xì)胞自溶或腐敗。盡可能避免血液、粘液等混入標(biāo)本內(nèi)，采集方法應(yīng)簡(jiǎn)便，操作輕柔，避免病人痛苦和引起嚴(yán)重并發(fā)癥及促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散，下面介紿幾種常用的標(biāo)本采集方法。
（一)直視采集法
外陰、陰道、陰道穹窿、宮頸、口www.med126.com腔、肛管、鼻腔、鼻咽部、眼結(jié)膜及皮膚等部位，可以直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗、食管、胃、直腸、氣管和肺內(nèi)支氣管則使用纖維內(nèi)鏡在病灶處直接刷取細(xì)胞制片。
（二)自然分泌液的采集法
1．痰液涂片檢查：痰興高采烈為支氣管等呼吸的分泌物，對(duì)支氣管肺癌和其它呼吸道疾病細(xì)胞學(xué)診斷具有重要價(jià)值。
2．尿液涂片檢查：收集尿液中脫落的泌尿道細(xì)胞成分，作泌尿道腫瘤和某些疾病的細(xì)胞學(xué)診斷。
3．乳頭溢涂片檢查：用于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和乳腺癌細(xì)胞學(xué)檢查。
4．前列腺液涂片檢查：采用前列腺按摩法取得分泌物，作前列腺細(xì)胞學(xué)診斷。
（三)灌洗洗
向空腔器官或腹腔、盆腔（剖腹探查時(shí))灌注一定量生理鹽水沖洗，使其細(xì)胞成分脫落于液體中，收集灌洗液離心制片，作細(xì)胞學(xué)檢查。
（四)磨擦法
利用磨擦工具在病變部位磨擦，將擦取物直接涂片。常用磨擦工具有海棉磨擦器、線網(wǎng)套、氣囊等。可分別用于鼻咽部、食管和胃部病灶的取材。
（五)針穿抽吸法
當(dāng)有胸腔、腹腔、心包腔及關(guān)節(jié)腔積液時(shí)，可用針穿抽吸部分積液作細(xì)胞學(xué)檢查。此外某些深部組織器官，如淋巴結(jié)、甲狀腺、軟組織、肝等亦可作細(xì)針穿刺吸取部分細(xì)胞進(jìn)行涂片診斷。
（一)涂片前準(zhǔn)備工作及涂片方法
1．涂片前準(zhǔn)備工作
（1)保證標(biāo)本新鮮，取材后盡快制片。
（2)涂操作要輕巧，避免擠壓以防止損傷細(xì)胞。涂片要均勻，厚薄要適度，太厚細(xì)胞堆疊，太薄細(xì)胞過(guò)少，均影響診斷。
（3)玻片要清潔無(wú)油漬，先用硫酸洗滌液浸泡沖洗，再用75%乙酸浸泡。
（4)含蛋白質(zhì)的標(biāo)本可直接涂片，缺乏蛋白質(zhì)的標(biāo)本，涂片前先在玻片上涂薄層粘附劑，以防止染色時(shí)細(xì)胞脫落，常用粘附劑為蛋白甘油，由等量生雞蛋白和甘油混合而成。
（5)每位患者的標(biāo)本至少涂?jī)蓮埐Ｆ�，以避免漏診。涂片后立即在玻片一端標(biāo)上編號(hào)。
2．涂片制備方法
（1)推片法：用于稀薄的標(biāo)本，如血液，胸、腹水等。取離心后標(biāo)本一小滴滴在玻片偏右側(cè)端，用推片用30度夾角將玻片上檢液輕輕向左推。
（2)涂抹法：適用于稍稠的檢液，如鼻咽部標(biāo)本。用竹棉簽在玻片上涂布，由玻片中心經(jīng)順時(shí)針?lè)较蛲廪D(zhuǎn)圈yin抹；或從玻片一端開始平行涂抹，涂抹要均勻，不宜重復(fù)。
（3)壓拉涂片法：將標(biāo)本夾于橫豎交叉的兩張玻片之間，然后移動(dòng)兩張玻片，使之重疊，再邊壓邊拉，獲得兩張涂片。該法適用于較粘稠標(biāo)本，如痰液。
（4)吸管推片法：用吸和將標(biāo)本滴在玻片一端，然后將滴管前端平行置于標(biāo)本滴上，平行向另一端均速移動(dòng)滴管即可推出均勻薄膜。此法亦適用于胸、腹水標(biāo)本。
（5)噴射法：用配細(xì)針頭的注射器將標(biāo)本從左至右反復(fù)均勻地噴射在玻片上，此法適用于各種吸取的液體標(biāo)本。
（6)印片法：將切取的病變組織用手術(shù)切開，立即將切面平放在玻片上，輕輕按印。此方法為活體組織檢查的輔助方法。
（二)涂片的固定
固定（fication)的目的是保持細(xì)胞自然形態(tài)，防止細(xì)胞自溶和細(xì)菌所致的腐敗；固定液能沉淀和凝固細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和破下細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶，使細(xì)胞不但保持自然形態(tài)，而且結(jié)構(gòu)清晰，易于著色。因此標(biāo)本愈新鮮，固定愈及時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)愈清晰，染色效果愈好。
1．固定液：細(xì)胞學(xué)檢查常用的固定液有下列三種：第一種乙醚酒清固定液：該固定液滲透明性較強(qiáng)，固定效果好適用于于一般細(xì)胞學(xué)常規(guī)染色；二種是氯仿酒精固定液：又稱卡諾氏固定液。其優(yōu)點(diǎn)同上；第三種95%酒精固定液：適用于大規(guī)模防癌普查。制備簡(jiǎn)單。但滲透作用稍差。
2．固定方法
（1)帶濕固定：涂片后未待標(biāo)本干燥即行固定的方法稱帶濕因定。此法因定細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，染色新鮮。適用于巴氏或HE染色。痰液、陰道分泌物及食管拉網(wǎng)涂片等常任常用此方法。
（2)干燥因定：涂片后未待其自然干燥，再行固定。適用于稀薄標(biāo)本如尿液、胃沖洗液等，也適用于于瑞特染色和姬姆薩染色。
3．固定時(shí)間：一般為15-30min。含粘液較多標(biāo)本，如痰液、陰道分泌物、食管拉網(wǎng)等因定時(shí)間在適當(dāng)延長(zhǎng)；尿液、胸、腹水等涂片不含粘液，固定時(shí)間可酌情縮短。
（三)涂片的染色
1．染色的目的和原理：染色的日的是借助于一種或多種染料，使組織和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分別著不同的染色，這樣在顯微鏡下能清楚地觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，作出正確判斷。
組織細(xì)胞染色原理至今尚無(wú)滿意的解釋，可能是物理作用，也可能是化學(xué)作用，或者是兩者綜合作用的結(jié) 果。
染色的物理作用是利用毛細(xì)管現(xiàn)象，滲透、吸收和吸附作用，使染料的色素顆粒牢固地進(jìn)入組織細(xì)胞，并使其顯色。
染色的化學(xué)作用是滲入組織細(xì)胞的染料與其相應(yīng)的物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有色的化合物。
各染料都具有兩種性質(zhì)，即產(chǎn)生顏色；征收被組織形成親和力。這兩種性質(zhì)主要由發(fā)色基因和助色基因所產(chǎn)生的。
發(fā)色基團(tuán)：苯的衍生物具有可見光區(qū)吸收帶。這些衍生物顯不的吸收帶與其價(jià)鍵的不穩(wěn)定性有關(guān)，如對(duì)苯二酚為無(wú)色，當(dāng)其氧化后失去兩個(gè)氫原子，它的分子或則變?yōu)橛悬S色的對(duì)醌，這種產(chǎn)生顏色的醌式環(huán)稱為發(fā)色基團(tuán)。若一種化合物含有幾個(gè)環(huán)，只要其中有一個(gè)醌式環(huán)就會(huì)發(fā)出顏色，稱此發(fā)色基團(tuán)為色原（chromogen).
助色基團(tuán)：是一種能使化合物以生電離作用的輔助原子團(tuán)（酸堿性基團(tuán))。它能使染色的色澤進(jìn)一步加深，并使其與被染色組織具有親和力。
助色基團(tuán)的性質(zhì)決定染料是酸性堿性。堿性染料具有堿性助色基團(tuán)，在溶媒中產(chǎn)生的帶色部分為帶正電荷的陽(yáng)離子，吻與組織細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合而顯色。如細(xì)胞核內(nèi)的主要化學(xué)成分脫氧化核糖核酸易被蘇木素染成紫藍(lán)色，稱嗜堿性。酸性染料具有酸性用力色基團(tuán)，在溶酶中產(chǎn)生帶色部分為陰離子，易與組織細(xì)胞內(nèi)帶正電荷部分結(jié)合而顯色，此性質(zhì)被稱為嗜酸性，如細(xì)胞漿內(nèi)訂成分為蛋白質(zhì)，易與伊紅或橘黃結(jié)合呈紅色或橘黃色。
2．常用染色方法：臨床日常工作中較為常用的染色方法有下列3種：
（1)巴氏染色法：本法染色特點(diǎn)是細(xì)胞具有多色性顏色，色彩鮮艷多彩。涂片染色的透明性好，胞質(zhì)顆粒分明，胞核結(jié)構(gòu)清晰，如鱗狀上皮過(guò)度角化細(xì)胞胞質(zhì)呈橘黃色；角化細(xì)胞顯粉紅色；而角化前細(xì)胞顯淺綠色或淺藍(lán)色，適用于上皮細(xì)胞染色或觀察陰道涂片中激素水平對(duì)上皮細(xì)胞的影響。此方法的缺點(diǎn)是染色程序比較復(fù)雜。
（2)蘇木精—伊紅（hemotoxylin eosin,HE)染色法：該方法染色透明度好，核與胞質(zhì)對(duì)比鮮明。染色步驟簡(jiǎn)便，效果穩(wěn)定。適用于痰液涂片，觖質(zhì)核呈紫藍(lán)色，胞質(zhì)淡玫瑰紅色，紅細(xì)胞呈淡朱紅色。
（3)瑞特—吉姆薩染色法（wrightgiemsa atain)；本方法多用于血液，骨髓細(xì)胞學(xué)檢查。胞質(zhì)內(nèi)顆粒與核安危質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示較清晰。操作簡(jiǎn)便。
為提高診斷率和防止造成差錯(cuò)，檢查涂片前必須嚴(yán)格核對(duì)涂片編號(hào)，了解送檢單上填寫的全部資料；閱片要全面、認(rèn)真、細(xì)心觀察。
因涂片中細(xì)胞成分分布極為分散，所以顯微鏡觀察時(shí)必須按順序視全張涂片，用推進(jìn)器從左至右。自上而下移動(dòng)，仔細(xì)觀察每一個(gè)視野，歸后將蓋片邊緣亦做仔細(xì)檢查，經(jīng)防止漏診（圖20-1)。
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圖20-1 觀察切片的移動(dòng)法
A錯(cuò)誤的玻片移動(dòng)法
B正確的玻片移動(dòng)法
涂片細(xì)胞學(xué)檢查十分重視低倍觀察，先宏觀涂片中各種細(xì)胞成分，發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞時(shí)，再轉(zhuǎn)換高倍視野，仔細(xì)觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，明確性質(zhì)，做出正確診斷。
（一)細(xì)胞學(xué)診斷的書寫方式
細(xì)胞學(xué)檢查癌細(xì)胞的診斷方式分為直接法和分級(jí)法。
1．直接法：根據(jù)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果，直接寫出關(guān)于疾病的診斷如痰抹片檢查結(jié)果為“倆支氣管鱗癌”。
2．分級(jí)法：將涂片中細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞變化，用分級(jí)方式表示。它的優(yōu)點(diǎn)是能真實(shí)地反映細(xì)胞學(xué)所見。較這客觀。目前有三級(jí)、四級(jí)、和五級(jí)三種分類方法。五級(jí)分類法過(guò)于繁瑣，實(shí)際應(yīng)用中較難掌握。因此國(guó)內(nèi)仍常用三級(jí)或四級(jí)分類法，該兩種分類法較為簡(jiǎn)單明確，易于掌握，能夠更準(zhǔn)確地反映涂片的本質(zhì)。
（1)三級(jí)分類法：將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為陰性，可疑和陽(yáng)性三級(jí)。
Ⅰ級(jí)：陰性：無(wú)核異質(zhì)細(xì)胞，涂片中均為正常細(xì)胞或一般退變細(xì)胞。
Ⅱ級(jí)：可疑。涂片中發(fā)現(xiàn)核異質(zhì)細(xì)胞，但不能肯定的是腫瘤細(xì)胞，應(yīng)重復(fù)送檢。
Ⅲ級(jí)：陽(yáng)性。涂片中發(fā)現(xiàn)典型癌細(xì)胞，有時(shí)根據(jù)癌細(xì)胞形態(tài)特征及分布，初步進(jìn)行分類。
（2)四級(jí)分類法：將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為陰性、核異質(zhì)，可疑和陽(yáng)性四級(jí)。
Ⅰ級(jí)：陰性。
Ⅱ級(jí)：核異質(zhì)。涂片中發(fā)現(xiàn)少量核異質(zhì)細(xì)胞，由高度炎癥增生所www.med126.com致。
Ⅲ級(jí)：可疑。涂片中見重度核異質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)基本符合惡性腫瘤細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，但數(shù)量過(guò)少，還不能完全排除癌前期病變或高度炎癥墳生的可能，建議臨床重復(fù)送檢。
Ⅳ級(jí)：陽(yáng)性。
（3)五級(jí)分類法
Ⅰ級(jí)：無(wú)核異質(zhì)細(xì)胞。
Ⅱ級(jí)：少量輕度核異質(zhì)細(xì)胞，但無(wú)惡性證據(jù)。
Ⅲ級(jí)：有較多重度核異質(zhì)細(xì)胞，但不能肯定為惡性。
Ⅳ級(jí)：有大量重度核異質(zhì)細(xì)胞，但仍缺乏典型惡性腫瘤細(xì)胞的證據(jù)。
Ⅴ級(jí)：發(fā)現(xiàn)典型惡性腫瘤細(xì)胞，根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)，作出初步的分類。
（二)提高細(xì)胞學(xué)診斷的要領(lǐng)
1．熟練掌握病理學(xué)：脫落細(xì)胞來(lái)自組織，所以是病變組織的部分反映，具有踏實(shí)的病理學(xué)基礎(chǔ)，才能對(duì)千變?nèi)f化的脫落細(xì)胞形態(tài)作出正確的判斷。
2．多思考、多比較：涂片中細(xì)胞成分，背景成分以及細(xì)胞變性程度等每例各不相同，閱片時(shí)要分析思考和比較，最好用涂片中某一背景成他，如淋巴細(xì)胞或紅細(xì)胞作標(biāo)本。
3．密切結(jié)合臨床：多與臨床醫(yī)生聯(lián)系，了解臨床癥狀，化驗(yàn)及影像診斷結(jié)果，避免盲目性。
4。認(rèn)識(shí)脫落細(xì)胞學(xué)的局限性：無(wú)充分證據(jù)，寧可保存守一點(diǎn)。未肯定的報(bào)告對(duì)臨床亦有參考價(jià)值。
5．了解各種染色的特性和優(yōu)缺點(diǎn)因不同染色方法，細(xì)胞表現(xiàn)差別很大。
（三)細(xì)胞學(xué)診斷的誤診原因
細(xì)胞學(xué)診斷誤診造成臨床診斷的錯(cuò)誤，以致影響對(duì)患者疾病的診斷治療。誤診形式有假陽(yáng)性和假陰性兩種。前者是在非腫瘤患者涂片中找到所謂的癌細(xì)胞；后者是在腫瘤患者涂片內(nèi)未找到癌細(xì)胞。
細(xì)胞學(xué)檢查從取材到最后診斷，任何一個(gè)步驟處理不當(dāng)，均可產(chǎn)生誤診。引起的誤診原因有以下幾種：
1．標(biāo)本取材不當(dāng)：未取到真有癌細(xì)胞部分，如痰液制片時(shí)未仔細(xì)選擇有效病理成分；或患者咳痰方式不對(duì)，未采集到支氣管深部分泌物等。
2．標(biāo)本不新鮮：細(xì)胞學(xué)檢查標(biāo)本必須在采集后1-2小時(shí)內(nèi)涂片，立即固定，以防止細(xì)胞自溶。
3．編號(hào)錯(cuò)誤：會(huì)發(fā)生誤診嘏造成醫(yī)療事故。故送檢標(biāo)本、申請(qǐng)單、涂片、報(bào)告單編號(hào)后應(yīng)仔細(xì)核對(duì)，避免出現(xiàn)差錯(cuò)。
4．細(xì)胞污染：涂片在固定和染色過(guò)程中，不斷有細(xì)胞脫落于試劑中，這些細(xì)胞有可能粘附在其它患者涂片上而造成誤診，故要經(jīng)常過(guò)濾或現(xiàn)換試劑。
5．觀察不仔細(xì)或方法不正確而發(fā)生的漏誤。
6．腫瘤細(xì)胞分化好，與正常細(xì)胞不易區(qū)別。
7．經(jīng)放療或化療后，正常上皮細(xì)胞受射線作用，有明顯的形態(tài)學(xué)改變，吻誤診為癌細(xì)胞。
