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CpG島甲基化是一種基因外修飾，在正常細(xì)胞中基因的甲基化大多發(fā)生在其啟動(dòng)子CpG 島之外，而在腫瘤細(xì)胞中某些抑癌基因的CpG島甲基化則導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄失活，故在腫瘤研究中檢測基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島甲基化狀態(tài)，對(duì)于闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及建立早期診斷方法均具重要意義。目前DNA甲基化的檢測方法比較多，其中廣泛應(yīng)用的技術(shù)是甲基化特異性的PCR技術(shù)(MSP)和甲基化敏感的單堿基延伸技術(shù)(Ms-SNuPE)，這些技術(shù)的敏感性高，特異性強(qiáng)，適用于微量DNA或石蠟包埋DNA。在MSP技術(shù)的基礎(chǔ)上，又先后發(fā)展了基于熒光檢測方法的實(shí)時(shí)定量PCR(MethyLight)和依賴于限制性核酸內(nèi)切酶的甲基化分析方法(COBRA)，這些技術(shù)提高了檢測的敏感性，實(shí)現(xiàn)了高通量和高特異性。此外，有人將MSP技術(shù)與變性高效液相色譜法(DNPLC)相結(jié)合，來測定整個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化。近年，中國科學(xué)院化學(xué)研究所與清華大學(xué)的研究人員合作，發(fā)展了基于水溶性陽離子型共軛聚合物的新DNA甲基化分析方法。通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)研究了質(zhì)粒和人腫瘤細(xì)胞p16基因啟動(dòng)子區(qū)特異CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)該技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性。引物無需熒光標(biāo)記,檢測在均相溶液中進(jìn)行，無需分離、純化等手段，而且與高通量分析兼容，在癌癥臨床診斷上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[5]。
2 胃癌相關(guān)基因的甲基化
近年研究結(jié)果顯示，多種基因的異常甲基化在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。有研究[6]表明，DNA的甲基化率在胃癌前病變轉(zhuǎn)化為癌的過程會(huì)發(fā)生改變。Kang等[7] 對(duì)非腫瘤胃黏膜和胃腫瘤進(jìn)行p16、hMLH1、DAP—kmase、THBS1、及TIMP-3等5種基因檢測，發(fā)現(xiàn)除DAP—kmase甲基化的頻率相近之外，其他基因從慢性胃炎到腸化生及從腺瘤到腺癌甲基化頻率都有不同程度的增高。因此認(rèn)為，這些基因的高甲基化在胃癌變發(fā)生過程中的較早階段就已出現(xiàn)，這為胃癌的早期診斷提供了新思路醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。
2.1 p16基因甲基化
p16基因又稱多腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor，MTS)，定位于9p21 位點(diǎn)，由2個(gè)內(nèi)含子和3 個(gè)外顯子組成。該基因編碼的蛋白是一種重要的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白，可與D型細(xì)胞周期蛋白(cyclinD)競爭性結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4 和CDK6而抑制蛋白激酶活性，使腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中抑癌基因Rb的表達(dá)產(chǎn)物(PRb)不能磷酸化而保持活化狀態(tài)，抑制轉(zhuǎn)錄因子EF解離，使細(xì)胞周期進(jìn)展最關(guān)鍵的G 1/S轉(zhuǎn)換停滯，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用。因此，p16 基因的變異或其蛋白的失活會(huì)導(dǎo)致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F調(diào)節(jié)途徑的失控，而使細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。目前研究表明p16基因的純合缺失和點(diǎn)突變異常多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。在胃癌中p16基因異常甲基化主要發(fā)生在外顯子1和啟動(dòng)子區(qū)域，且基因啟動(dòng)子的高度甲基化更為常見。Lee等[8]最早報(bào)道了p16 甲基化與胃癌的關(guān)系，他們用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶研究了9 個(gè)胃癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)2個(gè)細(xì)胞株有甲基化，而且不表達(dá)p16mRNA;體外以去甲基化劑5-deoxy-ezecytidine對(duì)胃癌細(xì)胞系處理后，因CpG島異常甲基化而封閉的基因又重新表達(dá)。Ficorella 等[9]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性胃癌中p16 基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化是導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄失活的重要原因。Bai等[10]利用誘發(fā)Wistar 大鼠胃癌模型研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠胃黏膜向胃癌演變過程中，p16 基因甲基化是在胃癌發(fā)生過程的較早階段出現(xiàn)，其甲基化的頻率在正常胃上皮中為2.7%， 在慢性萎縮性胃炎中為16.7%，在腸上皮化生中為37.5%，在胃腺瘤中為64.7%，在胃癌中則高達(dá)82.5%。Abbaszadegan 等[11]通過MSP 和免疫組化等方法同時(shí)對(duì)52 例胃癌患者組織和血清中p16基因甲基化及蛋白表達(dá)情況分析后，認(rèn)為p16 啟動(dòng)子區(qū)高甲基化在胃癌發(fā)生中起重要作用，并且與胃癌惡性程度相關(guān)。同時(shí)提出血清中DNA 甲基化水平的檢測可能是胃癌早期檢查的一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)。
2.2 DNA錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)、CpG甲基化表型(CIMP)與胃癌
研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌的發(fā)生中存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)和 CpG甲基化表型(CpG island methylator phenohype，CIMP)兩種分子途徑。在DNA MMR中起主要作用的是基因hMLH1 和hMSH2。MMR通過修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配、降低自發(fā)性突變，而增強(qiáng)DNA的保真性和維持基因組的穩(wěn)定性。Herman等[12]最早報(bào)告了在結(jié)直腸癌中MMR hMLH1失活與DNA甲基化有關(guān)，后來發(fā)現(xiàn)胃癌中同樣存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)亞型，但還沒有胃癌中有關(guān)DNA MMR發(fā)生突變的報(bào)道。Fleisher 等[13]檢測了65 例胃癌組織的hMLH1甲基化情況發(fā)現(xiàn)，隨著胃癌中MSI頻率的降低hMLH1基因的甲基化率也隨之降低。由此推測，hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與MSI有關(guān)，有可能是該基因失活的一種普遍機(jī)制。Poplawski等[14]通過甲基化敏感限制性內(nèi)切酶PCR(MSRE-PCR)對(duì)比分析27例胃癌患者與25 例健康人后認(rèn)為，hMLH1 甲基化對(duì)胃癌形成有促進(jìn)作用。由此可見，hMLH1啟動(dòng)子的甲基化與胃癌的發(fā)生有關(guān)，可能是胃癌發(fā)生機(jī)制中的早期分子事件。
