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SphK1突變抑制高糖培養(yǎng)的系膜細胞纖維連接蛋白過度表達的研究
[提要] 目的 研究鞘氨醇激酶-1（SphK1)突變是否抑制了高糖培養(yǎng)的系膜細胞中纖維連接蛋白（FN)的過度表達。 方法 采用Western blot檢測FN的表達。 結果 系膜細胞轉染了SphK1突變質粒后可消除高糖誘導的FN上調效應。 結論 本研究結果證明了SphK1在高糖誘導的系膜細胞FN表達過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。
[關鍵詞] SphK1；纖維連接蛋白；系膜細胞
[中圖分類號] R587.2；R692.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013)15-0010-02
系膜細胞（Mesangial cell，MC)是腎小球的主要功能細胞，無論在腎臟的生理功能還是病理變化中均發(fā)揮著重要的作用；現(xiàn)已認為MC主要參與了糖尿病腎病腎小球硬化損傷過 程。FN是由系膜細胞產(chǎn)生的細胞外基質的重要成分之一，在糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細胞FN等細胞外基質的積聚，導致腎小球硬化、促進糖尿病腎病的病變進 程[1]。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase， SphK)是催化S1P生成的關鍵限速酶[2]。我們前期研究表明：用四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠模型12周后醫(yī)學全在線gydjdsj.org.cn，模型組小鼠在腎小球結構異常、腎功能降低的基 礎上，SphK1蛋白表達與活性較正常組相比明顯升高；免疫組化結果顯示，小鼠腎組織的SphK1主要表達于腎小球細胞，而模型組與正常組相比顯著升高 [3]，提示在糖尿病狀態(tài)下SphK1的激活可能參與了糖尿病腎病的病變進程。本研究重點觀察SphK1對細胞外基質主要成分-FN的調節(jié)作用，探討糖尿 病狀態(tài)下高糖激活的SphK1對系膜細胞FN生成的具體分子機制。
1 材料與方法
1.1 腎小球系膜細胞原代培養(yǎng)
采用逐級過篩法從SD大鼠的腎臟分離得到腎小球，用完全培養(yǎng)基（DMEM+20%胎牛血清+胰島素 0.66 U/mL+ 2 mM谷氨酰胺+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL)約2滴，用吸管重懸腎小球，加入塑料培養(yǎng)瓶中，向各方向輕輕轉動培養(yǎng)瓶，使含腎小球的細胞懸液均勻分布于瓶底，待細胞懸液近干時，然后迅速倒 轉培養(yǎng)瓶（使培養(yǎng)面朝上)，加入約5 mL完全培養(yǎng)液，放入CO2孵箱內培養(yǎng)，4 h后，再輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉過來。待原代腎小球系膜細胞長滿瓶底后，吸棄培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)基，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶。加入0.25%胰蛋白酶消化約1～3 min，鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞突起回縮，細胞間隙增大，或輕輕振動后絕大部分細胞懸浮、漂移，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化，于1000 rpm離心5 min，傳代培養(yǎng)基懸浮GMC至所需濃度，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。實驗采用第3代到第15代之間的細胞。
1.2 質粒和瞬時轉染
空載體（Vector)，突變型質粒（SphKG82D)由澳大利亞Dr. Pu Xia贈送。按照產(chǎn)品說明書采用Lipofectamine 2000（Invitrogen)轉染系膜細胞72 h后收集細胞。
1.3 Western blot
細胞經(jīng)裂解提取蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉膜至PVDF。采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，將一抗、二抗孵育后，采用增強型的化學發(fā)光液檢測條帶信號。膜重孵鼠單抗 α-tubulin作為內參對照。
1.4 統(tǒng)計學分析
數(shù)值采用均值±標準差表示。采用單因素方差分析結合Bonferroni校正分析多組間的統(tǒng)計學差異，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
SphK1突變抑制了高糖誘導MC的FN表達醫(yī)學全在線gydjdsj.org.cn，MC分別轉染空質粒Vector和突變型質粒SphKG82D。結果表明，高糖能明顯上調FN 的表達；轉染了SphKG82D質粒后顯著抑制了高糖誘導的FN表達，而轉染Vector質粒無此效應，證明SphK1參與了高糖誘導的FN表達。
3 討論
系膜細胞是腎臟的主要功能細胞，糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細胞FN等細胞外基質成分的積聚是導致腎小球硬化、促進糖尿病腎病病變形成的重要特 征。因此，我們采用體外實驗進一步探討高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞S1P信號通路的激活與細胞外基質成分FN生成的關聯(lián)性，以明確高糖激活的S1P信號通路 參與糖尿病腎病病理進程的作用機制。
SphK1是催化S1P生成的關鍵酶[2，4，5]。研究表明：長期高血糖、AGEs、氧化應激等可激活SphK1，進而導致S1P的生成增 加[6-9]。以往研究表明S1P在腎小球系膜疾病中起著重要作用[10-12]。外源性S1P可顯著促進GMC增殖[10-12]，導致腎臟疾病的發(fā) 生。
近年來，SphK1-S1P信號通路與包括糖尿病腎病在內的糖尿病性血管并發(fā)癥的關系日益受到關注，成為相關領域研究的熱點。慢性高血糖現(xiàn)被 認為是糖尿病微血管及大血管病變的主要致病因素；血管內皮損傷是導致糖尿病慢性血管病變的起始環(huán)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖能夠誘導內皮細胞SphK1 的活化，參與了內皮損傷過程。同樣在高糖培養(yǎng)的內皮細胞中SphK活性也有顯著增加，采用siRNA技術證明高糖主要激活SphK16。高血糖狀態(tài)下形成 的AGEs現(xiàn)已證明是外周微血管病變的主要致病因素之一，導致糖尿病腎病和終末期腎衰竭。Geoffroy等用AGEs處理GMC，發(fā)現(xiàn)當AGEs低濃度 時醫(yī)學全在線gydjdsj.org.cn，神經(jīng)酰胺酶和鞘氨醇激酶活性明顯升高，導致S1P積聚，誘使GMC增殖。Geoffroy隨后觀察了STZ誘導小鼠4 d后腎臟中SphK1活性和S1P含量的變化，結果發(fā)現(xiàn)隨著腎小球系膜細胞輕度增殖，腎臟中SphK1活性和S1P均顯著增加，提示SphK1-S1P信 號通路可能參與了糖尿病腎小球增殖過程[8，9]。
本研究發(fā)現(xiàn)：在正常糖培養(yǎng)情況下，MC經(jīng)過高糖培養(yǎng)后，F(xiàn)N的表達顯著升高，而轉染突變型質粒SphKG82D的MC，幾乎完全抵消高糖誘導 的MC中FN上調效應，提示高糖誘導的FN過度表達需要SphK1的參與調節(jié)，為探尋將SphK1-S1P信號通路作為抗糖尿病腎病的可能作用靶點奠定基礎。
