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通過多孔β-TCP和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建人工骨研究示例論文
1.引言
創(chuàng)傷、腫瘤等原因引起的大塊骨缺損是骨科臨床的難題，目前尚缺乏理想的治療方法。近年來，組織工程骨的研究進(jìn)展為大塊骨缺損修復(fù)開辟了新的途徑，但離臨床應(yīng)用尚有較大距離，如何快速、大量地獲得種子細(xì)胞和構(gòu)建性能良好的支架材料是目前面臨的兩個關(guān)鍵性問題。許多研究證實，人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（Human Bone marrow derived mesenchymal stem cells, HBMSCs)具有良好的多向分化潛能，能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞分化。β-磷酸三鈣多孔陶瓷（Beta-tricalcium phosphate, β-TCP) 是近年來廣受關(guān)注組織工程骨支架材料，動物實驗證實其具有較好的生物相容性和較高的力學(xué)強度，并且能通過改變結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)降解時間，最終被新生骨爬行替代達(dá)到完全愈合 [4-6]。本研究結(jié)合兩者優(yōu)點，在體外構(gòu)建組織工程人工骨，并植入裸鼠皮下，驗證二者生物相容性和體內(nèi)成骨效果。
2.材料與方法
2.1主要試劑和儀器
低糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco, USA)，優(yōu)等胎牛血清（Hyclone, USA)，Percoll（1.073, Sigma, USA)，青霉素G鈉，硫酸鏈霉素，兩性霉素B（GIBCOBRL, Life Technologies, USA)，地塞米松，β-甘油磷酸，維生素C（Sigma, USA)，F(xiàn)K506 （Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd, Japan)，丙酮酸鈉（Sigma, USA)，TGF-beta 3（R&D Systems, Inc. USA)，重組人胰島素（優(yōu)沁林？常規(guī)，中國禮來公司)，轉(zhuǎn)鐵蛋白，亞硒酸，牛血清白蛋白，亞油酸（Sigma, USA)，IBMX（1-甲基3-異丁基-黃嘌呤)（Biosource, USA)，吲哚美辛（Cayman Chemical, USA)，油紅O（Sigma, USA)，抗CD29、CD44、CD34 及CD45單克隆抗體（Sigma)，Ⅰ、Ⅱ膠原抗體（SIGMA, USA)，生物素化二抗（DAKO, DENMARK)，多孔β-TCP（5 mm×5 mm×3mm， 400μm孔徑，75％多孔性)（Olympus Optical Co. Ltd, Japan)，培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶（Cornig, USA)。
2.2HBMSCs的分離與培養(yǎng)
經(jīng)患者知情同意，自胸椎骨折病人健康椎體取得骨髓10ml，肝素抗凝后密度梯度離心法離心，取中間單核細(xì)胞層以低糖DMEM洗滌兩次，接種入75cm2培養(yǎng)瓶（Cornig, USA)，以含10% FBS，100 units/ml 青霉素G鈉，100 μg/ml 硫酸鏈霉素， 0.25 μg/ml 兩性霉素B的低糖D-MEM培養(yǎng)。24h后換液，棄未貼壁的細(xì)胞，剩余的貼壁細(xì)胞主要是MSCs。以后每3天換液，待細(xì)胞生長至90%融合后消化傳代。以生長良好的第3代細(xì)胞為實驗細(xì)胞。
2.3人骨髓MSCs的生長曲線測定
以原代、第4代和第14代細(xì)胞為標(biāo)本，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為4×104個/ mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔200μL ，每3 d換液。分別于1、2、3、4、5、6、7、8 d， 每組取3孔行MTT法檢測，酶標(biāo)儀（Bio-Rad, Model 550) 讀取490 nm吸光度（A )值， 繪制細(xì)胞生長曲線。
2.4流式細(xì)胞儀檢測
取生長良好的第3代細(xì)胞，制成1×107/ml的單細(xì)胞懸液。取潔凈的普通塑料試管，分別加入熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體CD13-PE，CD29-FITC，CD34-FITC，CD45-PE，HLA-2-FITC， HLA-DR-FITC和同型陰性對照小鼠抗小鼠IgG單克隆抗體各20μl，每管加入細(xì)胞懸液100μl，混勻，室溫下孵育30min，每管加入1.5 ml PBS，混勻，離心5min（1800r/min)，棄上清，每管加200μl PBS，混勻后，Becton-Dickinson FACScan檢測，Apple公司隨機軟件分析，每個樣本分析10,000個細(xì)胞。
