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2.5體外多向誘導分化
2.5.1向成骨細胞誘導分化
細胞經(jīng)消化后調節(jié)密度為2×104個/ml，分別接種入12孔培養(yǎng)板和預置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板， 24小時后細胞完全貼壁，換以成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)（100 nM 地塞米松，50μM VitC，10nM β-磷酸甘油，50nM FK506)，同時設對照組仍以基本培養(yǎng)基培養(yǎng)，每三天換液。分別取第7，14天作堿性磷酸酶鈣鈷法染色，鈣Von Kossa染色和Ⅰ型膠原免疫組化。醫(yī).學全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn
2.5.2向軟骨細胞誘導分化
調節(jié)細胞密度為2×104/mL，接種入6孔板內(nèi)，以成軟骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)（1mM 丙酮酸鈉，0.1mM 維生素C，0.1nM 地塞米松，10ng/ml TGF-beta 3，6.25μg/ml 重組人胰島素，6.25μg/ml 轉鐵蛋白，6.25ng/ml 亞硒酸，1.25ng/ml 牛血清白蛋白，5.35μg/m l亞油酸)。分別培養(yǎng)至7、14天行Ⅱ型膠原免疫組化和Alcian 藍染色。
2.5.3向脂肪細胞誘導分化
細胞以2×104/mL種植于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，以成脂肪誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)（1μM 地塞米松，10mg/L 重組人胰島素，0.5mmol/L IBMX，100μM 吲哚美辛)。培養(yǎng)至第15天時作油紅O染色。
2.6體內(nèi)成骨活性研究
調節(jié)細胞密度為1×106cell/ml，將β-TCP立方塊浸入細胞懸液后立即在低壓環(huán)境（100mmHg)下作用100秒（10)，獲得MSCs/β-TCP復合物共52枚，隨機分為成骨誘導組和對照組，各以成骨誘導培養(yǎng)液和基本培養(yǎng)液培養(yǎng)2周后，將所有復合物植入26只雄性6周齡裸鼠（SCID，上海斯萊克實驗動物有限責任公司)背部皮下。
2.6.1掃描電鏡
接種24小時后待細胞貼壁牢靠，每組隨機取2枚復合物行掃描電鏡（Hitachi S520，Japan)觀察β-TCP內(nèi)部細胞情況。植入裸鼠體內(nèi)4、8周后，取出復合物，剔盡表面結締組織，生理鹽水洗凈，剃須刀片（飛鷹牌，上海刀片廠)沿中線切開，掃描電鏡觀察材料中心成骨情況。
3.結果
3.1倒置相差顯微鏡觀察
原代接種第一天即可見較多細胞貼壁，外觀呈紡錘形和多角形，并可見細胞核。72小時后細胞數(shù)量開始增多，細胞形態(tài)呈成纖維細胞樣，并可見較多細胞核內(nèi)有雙核仁，細胞呈集落樣生長。培養(yǎng)至12天左右細胞匯合達到90％左右，細胞呈極性排列，集落呈漩渦狀。細胞傳代后仍保持成纖維細胞樣外形，增殖速度很快，5-7天即再次匯合達90％。
3.2人骨髓MSCs生長曲線
骨髓MSCs生長曲線呈S形，接種后第1-2d為潛伏適應期，從第3 d 起細胞開始增殖并進入對數(shù)生長期，第8 d 達到高峰，以后進入平臺期。根據(jù)生長曲線可知骨髓MSCs的群體倍增時間為26 h。本實驗中P1、P4、P14細胞增殖速率無明顯差異（P＞0.1)。
3.3細胞表面標記物
經(jīng)流式細胞儀檢測，MSCs 均一地表達CD13、CD29，HLA-2，陽性率分別為99.97%，98.46%和94.27%；而CD34、CD45 和HLA-DR 陰性，陽性率分別為5.16%，1.34%和3.13%。
3.4成骨細胞誘導分化
3.4.1堿性磷酸酶鈣鈷法
誘導組細胞于第7天即可見陽性反應，第14天時陽性反應更明顯。而對照組兩個時間段陽性明顯較弱。
3.4.2鈣Von Kossa染色
誘導組細胞于第7天左右可見細胞表面，培養(yǎng)液內(nèi)有較多黑色細小顆粒出現(xiàn)，隨著誘導時間延長黑色顆粒明顯增加，第14天時陽性反應更明顯。
3.4.3Ⅰ型膠原免疫組化
誘導組細胞免疫組化染色呈陽性，對照組基本無陽性反應。
