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3.5軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化
3.5.1軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化
Ⅱ型膠原免疫組化呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)照組基本無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)。Alcian藍(lán)染色：誘導(dǎo)組細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，第14天時(shí)陽(yáng)性反應(yīng)更明顯。而對(duì)照組兩個(gè)時(shí)間段陽(yáng)性明顯較弱。
3.5.2脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化
14天后細(xì)胞形態(tài)逐漸向類圓形轉(zhuǎn)變，體積變大，胞漿內(nèi)出現(xiàn)少量圓形透亮小滴。油紅染色發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞胞漿內(nèi)大小不一的脂滴呈橘紅色，淺藍(lán)色胞核被擠于細(xì)胞一側(cè)或中央。
3.6掃描電鏡
接種24小時(shí)后，材料中心孔壁可見少量細(xì)胞貼附。細(xì)胞呈扁平狀，表面較光滑。復(fù)合物植入體內(nèi)4周后電鏡可見孔徑內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)明顯增殖，數(shù)量較前大大增多，且細(xì)胞外觀飽滿，表面有大量突起及纖維樣結(jié)構(gòu)與周圍細(xì)胞和材料連接，提示細(xì)胞功能處于活躍狀態(tài)。
3.7組織學(xué)檢查
分別于4，8周后取出植入物作組織學(xué)檢查。FK506處理組植入4周后，發(fā)現(xiàn)β-TCP微孔內(nèi)新骨生成明顯，幾乎每個(gè)微孔區(qū)內(nèi)均見較多骨組織，且小圓細(xì)胞罕見，提示植入物內(nèi)炎性反應(yīng)輕微；植入8周后取出者見微孔區(qū)內(nèi)有較多血管長(zhǎng)入，新骨量亦較前有顯著增加。但是，對(duì)照組植入4周和8周取出無(wú)明顯新骨生成，而疏松纖維組織明顯。
4.討論
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells, MSCs)因采集方便，分離擴(kuò)增技術(shù)成熟，有良好的多向分化潛能，是目前研究最多的骨組織工程種子細(xì)胞，具有極大的應(yīng)用前景。Sawyer 等將MSCs復(fù)合到多孔磷酸鈣陶瓷上進(jìn)行體外培養(yǎng)，MSCs表達(dá)成骨細(xì)胞表型，在陶瓷多孔中有纖連蛋白和骨鈣素蛋白合成。Song等發(fā)現(xiàn)供體MSCs能摻入到受體不同的組織中去，成為骨和軟骨等不同組織間質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源，表明MSCs在體內(nèi)不同組織的微環(huán)境作用下，可以定向分化形成不同譜系的細(xì)胞，獲得靶組織的表型。國(guó)內(nèi)也有研究利用堿性成纖維細(xì)胞因子和骨形成蛋白將MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)成骨，取得了很好的效果。而有關(guān)MSCs在體內(nèi)分化的具體機(jī)制有待深入研究。
要用于組織工程研究，分離與培養(yǎng)的細(xì)胞必須在形態(tài)學(xué)上和功能學(xué)上均滿足MSCs的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)以密度梯度離心法結(jié)合差異貼壁法分離人MSCs，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，細(xì)胞集落稱漩渦狀；生長(zhǎng)曲線與MSCs曲線一致；第3代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)均一表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源表面標(biāo)記CD13、CD29，HLR-1，而造血干細(xì)胞來(lái)源表面標(biāo)記CD34、CD45 和HLA-DR 陰性，且CD13、CD29，HLR-1陽(yáng)性率分別高達(dá)99.97%、98.46%和94.27%；所獲得的細(xì)胞在體外不同誘導(dǎo)條件下，能成功向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，證實(shí)其具有良好的多向分化潛能。本研究從形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上充分證實(shí)，以此方法所獲取的人MSCs具有高純度，強(qiáng)增殖能力和分化潛能的特點(diǎn)，完全滿足組織工程研究的需要，所獲得的細(xì)胞可建立細(xì)胞株用于后續(xù)研究，此方法可作為常規(guī)方法用于獲取MSCs。醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn
β-TCP化學(xué)成分與鈣磷比值接近于正常骨組織，具有良好的生物相容性，可在體內(nèi)降解，并可通過(guò)調(diào)節(jié)孔隙率和孔徑按需調(diào)節(jié)其生物力學(xué)強(qiáng)度和降解速度，已被較多研究證實(shí)為極具研究前景的人工骨支架材料，對(duì)于構(gòu)建一理想的骨移植替代物用于骨科臨床，以期達(dá)到移植物被新生骨替代而使骨缺損達(dá)到完全愈合。Hoshino等2007年將未經(jīng)誘導(dǎo)的兔MSCs直接接種于多孔β-TCP修復(fù)自體顱骨缺損，發(fā)現(xiàn)其可在體內(nèi)誘導(dǎo)、分化為成骨細(xì)胞，并對(duì)顱骨缺損進(jìn)行了有效的修復(fù)，提示多孔β-TCP不僅能夠提供一個(gè)組織生長(zhǎng)的三維支架結(jié)構(gòu)，還能為被移植的干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化并形成骨組織提供一個(gè)良好的微環(huán)境。國(guó)內(nèi)白峰等2007年研究發(fā)現(xiàn)，支架材料孔隙間的連通是影響材料體內(nèi)血管化的關(guān)鍵因素，較高的連通率可以使材料血管化更為完全，而連通徑的大小可以限制新生血管管腔的大小。400μm孔徑，75％多孔性的β-TCP支架能提供較理想的血管化，從而加速骨再生的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)所用多孔β-TCP為5 mm×5 mm×3mm， 400μm孔徑，75％多孔性，體內(nèi)降解時(shí)間為8-12周。實(shí)驗(yàn)組支架植入裸鼠皮下后，植入物內(nèi)小圓細(xì)胞較少，提示炎性反應(yīng)輕微；植入8周后取出者見微孔區(qū)內(nèi)有較多血管長(zhǎng)入；新骨量隨時(shí)間增長(zhǎng)顯著增加，說(shuō)明所采用多孔β-TCP具有優(yōu)良的生物相容性，有利于支架血管化，從而進(jìn)一步促進(jìn)新骨生成。本實(shí)驗(yàn)將人MSCs與β-TCP結(jié)合并植入裸鼠皮下，觀察到成骨誘導(dǎo)組成骨能力強(qiáng)于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)其具備良好的體內(nèi)誘導(dǎo)成骨能力。
本實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs有強(qiáng)大的增殖和成骨能力，而β-TCP具有優(yōu)良的生物相容性及誘導(dǎo)MSCs體內(nèi)成骨能力，是理想的組織工程化人工骨種子細(xì)胞和支架材料。如進(jìn)一步深入研究，有望開發(fā)出臨床可應(yīng)用的組織工程人工骨產(chǎn)品。
