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| 實驗十一 DNA的電泳及限制性內(nèi)切酶譜分析 | ||||||||||||||||
【實驗?zāi)康摹?/p> 掌握限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點；熟悉DNA限制性內(nèi)切酶譜分析的基本原理及實驗操作技術(shù)。 【實驗原理】 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease，RE) 是由細(xì)菌自身產(chǎn)生的能識別雙鏈DNA分子中的特定堿基序列，并以內(nèi)切方式水解核酸中的磷酸二酯鍵的核酸水解酶。它可分為三種類型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能識別雙鏈DNA的特異序列，并在這個序列內(nèi)進(jìn)行切割，它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被譽(yù)為分子生物學(xué)家的手術(shù)刀。臨床上某些遺傳病是由于基因的缺失或插入或突變所致，可造成 RE 酶切位點的改變，故當(dāng)用一定的RE切割時，其切開的片段（分子量)大小與正常人發(fā)生差異，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，可產(chǎn)生不同的電泳圖譜，即DNA限制性圖譜發(fā)生改變，據(jù)此可達(dá)到基因診斷的目的。 實驗可選用價格低廉、酶切效果好的EcoRⅠ（識別位點G↓AATTC)對λDNA 進(jìn)行酶切，觀察RE的特定切割作用及其限制性圖譜，理論上可產(chǎn)生分子量分別為21,226bp，7,421bp，5,804bp，5,604bp，4,878bp和3,530bp的片段。 【實驗試劑和器材】 1．試劑 ⑴ DNA底物：λDNA或制備的肝組織 DNA 或其它含有EcoRⅠ酶切位點的重組質(zhì)粒 DNA。 ⑵ 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及其緩沖液：購買的限制性內(nèi)切酶均配有相應(yīng)的緩沖液，在配套的緩沖液中，該限制性內(nèi)切酶均可獲得接近100%酶切活性。 ⑶ 50×TAE電泳緩沖液：取Tris 24.2g，冰乙酸5.7mL，0.25mol/LEDTA (pH8.0) 20 mL，加蒸餾水至100 mL。1×TAE為配制瓊脂糖凝膠及其電泳時的應(yīng)用緩沖液。 ⑷ 溴酚藍(lán)指示劑溶液（6×上樣緩沖液)：稱取溴酚藍(lán)（bromophenol blue)100 mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖25 g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中，搖勻后定容至 50 mL，加入NaOH 1滴，調(diào)至藍(lán)色。 ⑸ 溴化乙錠（ethidium bromide，EB，1 mg/mL)：戴手套謹(jǐn)慎稱取EB 20 mg于棕色試劑瓶中，加 20 mL雙蒸水，溶解后貯于4℃?zhèn)溆�，配制瓊脂糖凝膠時每100 mL凝膠加50 μLEB。 ⑹ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)需要購買，一般濃度為0.5 μg/μL。 2．器材 ⑴ 電泳儀及水平電泳槽。 ⑵ 移液器及吸頭。 ⑶ 0.5 mL Eppendorf管（EP管)及一次性手套。 ⑷ 錐形瓶、量筒、刻度吸管。 ⑸ 微波爐或電爐。 ⑹ 水平臺。 ⑺ 紫外分析儀。 ⑻ 照相機(jī)及紅色濾光片。 【實驗步驟】 1．樣品DNA酶切 將酶切緩沖液2 μL，λDNA 5 μg (可用基因組DNA或質(zhì)粒DNA樣品代替)，EcoRⅠ5~10U加至0醫(yī).學(xué)全在線.5 mL EP管中，加雙蒸水至20 μL，加蓋，混勻后稍離心，37 ℃水浴反應(yīng)1h。 2．制備瓊脂糖凝膠 按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量（見表2-7)。 表2-7 瓊脂糖凝膠濃度與分辨 DNA 大小范圍的關(guān)系
稱取 0.8g 瓊脂糖倒入錐形瓶中，加入 1×TAE 緩沖液 100 mL，置微波爐或水浴加熱至完全熔化，取出搖勻，稍冷卻后加50 μL EB染色液，搖勻。 3．灌膠 ⑴ 取潔凈的電泳內(nèi)槽（又稱托盤)，用橡皮膏或透明膠帶將內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定要封嚴(yán)，不能留縫隙)。 ⑵ 將內(nèi)槽放置于一水平臺面上，并插好所需齒數(shù)和厚度的樣品梳子。 ⑶ 將冷卻至60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩慢倒入內(nèi)槽，直至所需厚度，注意不要形成氣泡，特別是梳子下，如有氣泡可用牙簽挑破。 ⑷ 待膠冷卻凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明膠帶，將帶凝膠的內(nèi)槽放入電泳槽中，注意凝膠點樣端要靠近負(fù)極。 ⑸ 加入1×TAE緩沖液至電泳槽，緩沖液剛好沒過凝膠表面即可。 4．加樣 剪取適當(dāng)大小的蠟?zāi)ぃ≒arafilm膜)，取 6×上樣緩沖液1 μL點于膜上數(shù)點。取5 μL酶切后的樣品，0.5~1 μg未酶切質(zhì)粒DNA，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)分別與上樣緩沖液混勻，將其分別加入凝膠的點樣孔內(nèi)（記錄點樣順序及點樣量)。 5．電泳 接通電泳槽與電泳儀的電源（檢查正、負(fù)極，DNA片段是從負(fù)極向正極移動)。DNA 的遷移率與電壓成正比，電壓不超過5V/cm凝膠長度。當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動至凝膠前沿1~ 2cm處，切斷電源，停止電泳。 6．觀察結(jié)果 取出內(nèi)槽，在紫外分析儀的玻璃平板上小心推出凝膠，通過防護(hù)屏或戴防護(hù)眼鏡觀察紫外燈透射的結(jié)果，DNA條帶處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶，可觀察到酶切與未酶切后的DNA條帶的泳動位置。 7．?dāng)z影 在鏡頭前加一塊紅色濾光片，利用透射紫外光作光源，光圈 2.8，曝光0.5~2s，調(diào)準(zhǔn)焦距，可拍攝質(zhì)量較好的凝膠照片，有條件時則使用DNA一次成像儀。 【實驗注意事項】 1．本實驗可先進(jìn)行酶切反應(yīng)，在等待酶切過程的時間間隙灌好瓊脂糖凝膠。 2．進(jìn)行DNA酶切時，要在其最適溫度下（大多數(shù)為37℃)進(jìn)行。最好是用每一種酶的專用緩沖液，以達(dá)到最佳酶切效果。如遇兩種酶進(jìn)行酶切，應(yīng)先用低鹽緩沖液，后用高鹽緩沖液，或一種酶切結(jié)束后加TE至 400 μL，再進(jìn)行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二個酶切反應(yīng)體系。 3．限制性內(nèi)切酶一定要在低溫（-20℃)下貯存，因含50%甘油，在此溫度下一般不會凍結(jié)，如發(fā)生凍結(jié)則表明冰箱溫度低于-20℃。新購的大包裝限制酶，應(yīng)先進(jìn)行分裝。每次取用時，應(yīng)將限制酶移至冰盒內(nèi)，用完后立即放回-20℃冰箱；每次吸取酶時，應(yīng)使用新的滅菌吸頭，以避免污染。 4．進(jìn)行大量酶切時，先要確定限制酶的濃度。一般1U限制酶于37℃條件下作用底物DNA 1h以上可切割1μg DNA。一般說來，要用2~3倍的酶量才能保證完全消化，對基因組DNA尤其如此。 5．酶切基因組DNA是否完全，可通過紫外觀察結(jié)果來判斷。如看到DNA片段呈均勻遞減的一條區(qū)帶，加樣孔處無大量DNA堆積，則表示酶切完全。 6．對多個樣品基因組DNA分別酶切電泳攝影，繪制出多個樣品的DNA限制性內(nèi)切酶圖譜，即可分析做出基因診斷。 7．為便于電泳后直接可觀察結(jié)果，溴化乙錠（ethidium bromide，EB)可在瓊脂糖加熱熔化時加入。注意：EB是DNA的誘變劑，亦是極強(qiáng)的致癌gydjdsj.org.cn/jianyan/物，配制和使用過程中要小心，操作時一定要戴手套，用過的手套要及時將其翻過來，讓污染有EB的面朝里，有EB的廢液和器皿要分別處理好。 【思考題】 1. 結(jié)果觀察為什么一定要在紫外分析儀下觀察？ 2. 瓊脂糖凝膠中為什么要加溴化乙錠？能否不加？
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