實驗四 細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢查
各種細(xì)菌具有各自的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同。利用這一生物學(xué)特性，可以用來鑒別細(xì)菌，這種方法稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)。
一、細(xì)菌對糖的分解
（一)糖發(fā)酵試驗
【原理】
各種細(xì)菌具有不同的酶，分解糖的能力不同，代謝產(chǎn)物亦不同。有的不能分解某些糖類；有的分解某些糖產(chǎn)酸(如甲酸、乙酸、乳酸等)產(chǎn)氣(如氫、二氧化碳等)；有的則只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。因此，可用來鑒別細(xì)菌。
【材料】
1．大腸桿菌、傷寒桿菌18～24h斜面培養(yǎng)物。
2．葡萄糖、乳糖發(fā)酵管。
【方法】
1．將大腸桿菌、傷寒桿菌分別接種于1支葡萄糖和1支乳糖發(fā)酵管。
2．將上述糖發(fā)酵管置37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
葡萄糖 乳 糖
大腸桿菌 ⊕ ⊕
傷寒桿菌 ＋ －
（二)V-P試驗
【原理】
某些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌,分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中，被氧化為二乙酰，再與培養(yǎng)基內(nèi)胍基結(jié)合，生成紅色化合物為V-P (Voges-Proskauertest) 試驗陽性。
【材料】
1．V-P試劑。
2．大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌18～24h斜面培養(yǎng)物。
3．葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。
【方法】
1．分別將大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌接種于2支葡萄糖蛋白胨水中。
2．置37℃培養(yǎng)48h后，取出分別加入KOH 1ml和α-萘酚溶液1m1，搖勻，靜置5～15min，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
大腸桿菌：－ 產(chǎn)氣桿菌：＋
（三)甲基紅試驗
【原理】
某些細(xì)菌如大腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反應(yīng)。若產(chǎn)酸量少或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為醇、酮、醛、氣體和水等，則培養(yǎng)基的酸堿度仍在pH 6.2以上，加入甲基紅指示劑呈黃色，為陰性反應(yīng)。
【材料】
1．甲基紅試劑。
2．大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌18～24h斜面培養(yǎng)物。
3．葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。
【方法】
1．分別將大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌接種于2支葡萄糖蛋白胨水中。
2．置37℃培養(yǎng)2～3d后取出，分別滴加甲基紅試劑2～3滴，混勻，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
大腸桿菌：＋ 產(chǎn)氣桿菌：－
（四)枸櫞酸鹽利用試驗
【原理】
枸櫞酸鹽培養(yǎng)基中枸櫞酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源.有的細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，可利用枸櫞酸鹽作為碳源，分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變堿，指示劑溴麝香草酚蘭由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色，為枸櫞酸鹽利用試驗陽性。
【材料】
1．大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌18～24h斜面培養(yǎng)物。
2．枸櫞酸鹽斜面。
【方法】
1．分別將大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌接種于2支枸櫞酸鹽斜面。
2．置37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
大腸桿菌：－ 產(chǎn)氣桿菌：＋
二、含氮化合物分解試驗
（一)靛基質(zhì)(吲哚)產(chǎn)生試驗
【原理】
某些細(xì)菌如大腸桿菌、變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)(吲哚)，再與試劑對二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)后，生成紅色化合物—玫瑰吲哚，即為陽性。
【材料】
1．吲哚試劑(對www.med126.com二甲基氨基苯甲醛)。
2．大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌18～24h斜面培養(yǎng)物。
3．蛋白胨水培養(yǎng)基。
【方法】
1．分別將大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌接種于2支蛋白胨水中。
2．置37℃培養(yǎng)48h后，每管加吲哚試劑2～3滴，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
大腸桿菌：＋ 產(chǎn)氣桿菌：－
（二)硫化氫產(chǎn)生試驗
【原理】
某些細(xì)菌如變形桿菌能分解含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸)產(chǎn)生硫化氫。硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽結(jié)合，生成硫化鉛或硫化亞鐵黑色沉淀物即為陽性。
【材料】
1．大腸桿菌、變形桿菌18～24h斜面培養(yǎng)物。
2．醋酸鉛培養(yǎng)基。
【方法】
1．分別將大腸桿菌、變形桿菌接種(穿刺法)于2支醋酸鉛培養(yǎng)基。
2．置37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
變形桿菌：＋ 大腸桿菌：－
（三)尿素分解試驗
【原理】
某些細(xì)菌如變形桿菌，產(chǎn)生尿素酶，能分解尿素產(chǎn)氨。氨溶于水變成氫氧化銨，使培養(yǎng)基變堿，加入酚紅指示劑呈紅色，即為陽性。
【材料】
1．變形桿菌、痢疾桿菌18～24h斜面培養(yǎng)物。
2．尿素培養(yǎng)基。
【方法】
1．分別將變形桿菌、痢疾桿菌接種于2支尿素培養(yǎng)基。
2．置37℃培養(yǎng)18～24h后，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
變形桿菌：＋ 痢疾桿菌：－
三、細(xì)菌產(chǎn)生的酶
細(xì)菌在合成代謝中能產(chǎn)生一些酶，如血漿凝固酶、透明質(zhì)酸酶、氧化酶等，通過細(xì)菌產(chǎn)生的酶試驗可以了解其致病作用。
氧化酶試驗
【原理】
某些細(xì)菌如奈瑟菌和綠膿桿菌，具有氧化酶(靛基酚氧化酶)，能將氧化酶試劑(鹽酸甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺)氧化成紅色的醌類化合物，即為試驗陽性。
【材料】
1．0.5～1%鹽酸對二甲基氨基苯胺(或鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸對氨基二甲苯胺)水溶液。
2．巧克力色培養(yǎng)基。
【方法】
1．將腦膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌、白色葡萄球菌分別接種肉湯管或巧克力色平板。
2．置37℃培養(yǎng)24h后，滴加新鮮配制的0.5～1%鹽酸對二甲氨基苯胺水溶液2～3滴，培養(yǎng)液呈紅色，或在固體培養(yǎng)基上，加試劑后菌落出現(xiàn)紅色→深紅色→紫黑色變化均為陽性。
【結(jié)果】
腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌：＋ 白色葡萄球菌：一
【注意事項】
1．此試驗應(yīng)避免含鐵物質(zhì)，因遇鐵后出現(xiàn)假陽性。
2．試劑在空氣中易氧化，故應(yīng)新配制，冰箱保存使用不超過2W。
3．若要分離培養(yǎng)腦膜炎奈瑟菌，應(yīng)在菌落變成紫黑色之前立即轉(zhuǎn)種，否則細(xì)菌容易死亡。
四、細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測—鱟溶解物試驗
【原理】
鱟溶解物試驗又稱鱟試驗，是用鱟血液中變形細(xì)胞的裂解物作為試劑，檢測細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖)的一種快速、簡單、敏感的試驗方法。內(nèi)毒素可激活鱟變形細(xì)胞溶解物中的一種酶，此酶活化后可促使溶解物中蛋白質(zhì)呈凝膠狀態(tài)。此法可以測出極微量的內(nèi)毒素(0.1～lng/m1)。常用來檢測注射制劑、生物制品、醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)腦脊液、血液等標(biāo)本中的內(nèi)毒素。
【材料】
1．鱟試劑(0.1ml凍干品)。
2．測試品(注射劑、血液或細(xì)菌培養(yǎng)上清液等)、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(國際統(tǒng)一規(guī)定大腸桿菌內(nèi)毒素，含量為0.1～1μg/m1)、蒸餾水。
3．1ml吸管、37℃水浴箱等。
【方法】
1．打開3支鱟試劑凍干品安瓿，各加入0.1ml蒸餾水溶解，編號。
2．3支鱟試劑中分別加入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素、蒸餾水、測試品各0.1ml，搖勻。
3．垂直放入37℃水浴15～30min，取出。
【結(jié)果判斷】
1．安瓿傾斜45°，結(jié)果記錄如下：
+++ 強(qiáng)陽性，呈固體狀。
++ 陽性，呈凝膠狀，有變形但不流動
+ 弱陽性，呈粘性半流動狀。
一 陰性，呈能流動未凝固狀。
2．凡結(jié)果陽性者，表示內(nèi)毒素陽性。
