尖銳濕疣

【概述】　返回

　　本病又稱尖圭濕疣、生殖器疣或性病疣。是由人類乳頭瘤病毒（HPV)感染引起的一種性傳播疾病。HPV有多種類型，引起本病的主要類型為HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，其中HPV16和18型長(zhǎng)期感染可能與女性宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。

【診斷】　返回

　　1．不潔性交史。

　　2．典型皮損為生殖器或肛周等潮濕部位出現(xiàn)丘疹，乳頭狀、菜花狀或雞冠狀肉質(zhì)贅生物，表面粗糙角化。

　　3．醋酸白試驗(yàn)陽(yáng)性，病理切片可見角化不良及凹空細(xì)胞。

　　4．核酸雜交可檢出HPV-DNA相關(guān)序列，PCR檢測(cè)可見特異性HPV-DNA擴(kuò)增區(qū)帶。

【治療措施】　返回

　　由于目前沒有特效的抗病毒藥物，尖銳濕疣的治療必須采用綜合治療。

　�。ㄒ�)治療誘因：（白帶過(guò)多，包皮過(guò)長(zhǎng)、淋病)。

　�。ǘ�)提高機(jī)體免疫力。

　�。ㄈ�)應(yīng)用抗病藥物。一般只要堅(jiān)持規(guī)則的綜合治療都可治愈。

　　1．　手術(shù)療法

　　對(duì)于單發(fā)、面積小的濕疣，可手術(shù)切除；對(duì)巨大尖銳濕疣，可用Mohs氏手術(shù)切除，手術(shù)時(shí)用冷凍切片檢查損害是否切除干凈。

　　2．　冷凍療法

　　利用-196℃低溫的液體氮，采用壓凍法治療尖銳濕疣，促進(jìn)疣組織壞死脫落，本法適用于數(shù)量少，面積小的濕疣，可行1-2次治療，間隔時(shí)間為一周。

　　3．　激光治療

　　通常用CO2激光，采用燒灼法治療尖銳濕疣，本療法最適用女陰、陰莖或肛周的濕疣。對(duì)單發(fā)或少量多發(fā)濕疣可行一次性治療，對(duì)多發(fā)或面積大的濕疣可行2-3次治療，間隔時(shí)間一般為一周。

　　4．　電灼治療

　　采用高頻電針或電刀切除濕疣。方法：局部麻醉，然后電灼，本療法適應(yīng)數(shù)量少，面積小的濕疣。

　　5．　微波治療

　　采用微波手術(shù)治療機(jī)，利多卡因局麻，將桿狀輻射探頭尖端插入尖銳濕直達(dá)疣體基底，當(dāng)看到就體變小、顏色變暗、由軟變硬時(shí)，則熱輻射凝固完成，即可抽出探頭。凝固的病灶可以用鑷子挾除。為防止復(fù)發(fā)，可對(duì)殘存的基底部重復(fù)凝固一次。

　　6．　β-射線治療

　　我們應(yīng)用β-射線治療尖銳濕疣取得了較為滿意的效果，該方法療效高，無(wú)痛苦、無(wú)損傷、副作用少，復(fù)發(fā)率低，在臨床上有推廣價(jià)值。

　　7．　藥物療法

　�。�1)足葉草脂：本療法適用濕潤(rùn)區(qū)域的濕疣，例如發(fā)生于包皮過(guò)長(zhǎng)而未曾作包皮環(huán)切除手術(shù)的龜頭及會(huì)陰部的濕疣。但對(duì)宮頸尖銳濕疣不能用足葉草脂治療。用20%足葉草脂酊劑涂到皮損處或用藥前，先有油質(zhì)抗菌藥膏保護(hù)皮損周圍的正常皮膚或粘膜 ，然后涂藥，用后4-6小時(shí)，用30%硼酸水或肥皂水清洗，必要時(shí)3天后重復(fù)用藥，該藥是國(guó)外用于本病治療的首先藥，一般用一次可愈。但有很多缺點(diǎn)，如對(duì)組織破壞性大，使用不當(dāng)可引起局部潰瘍。毒性大，主要表現(xiàn)為惡心、腸梗阻、白細(xì)胞及血小板減少，心動(dòng)過(guò)速、尿閉或少尿，故使用時(shí)必須謹(jǐn)慎，發(fā)現(xiàn)上述反應(yīng)時(shí)，應(yīng)立即停藥。

　　（2)抗病毒藥：可用5%酞丁胺霜?jiǎng)�，或�?.25%皰疹凈軟膏，每日2次，外涂。無(wú)環(huán)鳥苷口服，每日5次，每次200mg，或用其軟膏外用，α-干擾素每日注射300萬(wàn)單位,每周用藥五天�；蚋蓴_素300萬(wàn)單位注入疣體基部，每周2次。連用2-3周，主要副作用為流感樣綜合癥，局部用藥副作用較少且輕微。

　�。�3)腐蝕劑或消毒劑：常用有30%-50%三氯醋酸或飽和二氯醋酸，或18%過(guò)氧乙酸。用10%水楊酸冰醋酸或40%甲醛、2%液化酚、75%乙醇蒸餾水100ml混合溶液，點(diǎn)涂局部，用于龜頭、肛周濕疣，每日或隔日一次，效果甚好。消毒劑可用20%碘酊外涂，或2.5-5%碘酊注射于疣體基部，每次0.1-1.5ml，或用新潔爾滅外涂或以0.1-0.2%外敷，后者需配合全身療法。

　　（4)抗癌藥

　�、� 5-氟脲嘧啶(5-F u)：一般外用5%軟膏或霜?jiǎng)�，每�?次，3周為一療程。2.5%~5%氟脲嘧啶濕敷治療陰莖、肛周尖銳濕疣，每次敷20分鐘，每日一次，6次為一療程。也可用聚乙二醇作基質(zhì)，加入占其干質(zhì)5%的5- F u粉劑制成栓劑，治療男女尿道內(nèi)尖銳濕疣，也可用5- F u基底注射，多者可分批注射。

　　② 噻替哌：主要用于5-F u治療失敗的尿道內(nèi)尖銳濕疣，每日用栓劑（每個(gè)含15mg)，連用8天，也可將本品60mg加入10-15ml消毒水中，每周向尿道內(nèi)滴注，保持半小時(shí)，副作用有尿道炎。亦可用本品10mg加入10ml浸泡患處，每日3次，每次半小時(shí)，治療陰莖、龜頭冠狀溝濕疣，主要用于經(jīng)其它方法治療后，尚有殘存疣體或復(fù)發(fā)者。也可將此溶液再稀釋兩倍浸泡局部，以預(yù)防復(fù)發(fā)。醫(yī)學(xué)全.在.線gydjdsj.org.cn

　�、� 秋水仙鹼：可用2-8%的生理鹽水溶液外涂，涂?jī)纱�，間隔72小時(shí)治療陰莖濕疣，涂后可出現(xiàn)表淺糜爛。

　�、� 爭(zhēng)光霉素或平陽(yáng)霉素：用0.1%的生理鹽水溶液作皮損內(nèi)注射，每次總量限制在1毫升（1 mg)，大多一次可愈。平陽(yáng)霉素為爭(zhēng)光霉素?fù)Q代品，用法基本相同，亦有用平陽(yáng)霉素10 mg溶于10%普魯卡因20ml內(nèi)注射。

　　8．免疫療法

　�、� 自體疫苗法:用病人自己的疣體組織勻漿(融冷滅活病毒)，并進(jìn)行加熱處理（56℃一小時(shí))收集上清液注射，可用于頑固性肛周濕疣。

　　② 干擾素誘導(dǎo)劑：可用聚肌胞及梯洛龍。聚肌胞每日注射2 ml，連用10天，停藥1-2月后，再繼續(xù)用藥。梯洛龍每日3次，每次300 mg，停藥4天，或隔日口服600 mg。

　�、� 干擾素、白介Ⅱ，靈桿菌素，利百多聯(lián)合應(yīng)用，療效較佳。

　�。ㄋ�)中醫(yī)治療

【病原學(xué)】

　　HPV在皮膚上引起疣贅、在咽部、肛周、生殖器粘膜上形成增殖性病變，其病毒型為小型DNA病毒。感染HPV發(fā)生病變多數(shù)屬于良性，能自行消退，但也有惡化病例。如肛周、生殖器粘膜上形成扁平上皮癌的報(bào)道。還有罕見的遺傳性皮膚疾患、疣贅狀表皮發(fā)育異常癥（EV)續(xù)發(fā)的皮膚癌等，在癌細(xì)胞中檢出HPV。

　　HPV為乳多空病毒科A屬成員，病毒顆粒直徑50-55nm無(wú)被膜的正20面體構(gòu)成的病毒殼體，具有7900堿基對(duì)的環(huán)狀雙鏈DNA組成，電鏡下病毒顆粒的大小、形態(tài)與口多瘤病毒極為相似。乳頭瘤病毒（PV)具有種屬特異性，HPV尚未能在組織培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型中繁殖。

　　病毒的結(jié)構(gòu)蛋白組成：85%的PV顆粒，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS——PAGE)可確定病毒有主要衣殼蛋白、分子量為56.000；次要衣殼蛋白，分子量遷移于76.000處，發(fā)現(xiàn)4種細(xì)胞組蛋白與病毒DNA相關(guān)。

　　所有HPV病毒的基因組結(jié)構(gòu)相似，根據(jù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行DNA雜交的程序可確定病毒的型和亞型，不同的HPV型DNA與其他類型病毒DNA僅50%出現(xiàn)交叉雜交，迄今已發(fā)現(xiàn)60多種HPV類型，隨著研究的深入，將會(huì)鑒定出更多HPV新的類型。

【發(fā)病機(jī)理】　返回

　　尖銳濕疣的HPV感染通過(guò)性接觸傳播，接觸部位的小創(chuàng)傷可促進(jìn)感染，三種鱗狀上皮（皮膚、粘膜、化生的)對(duì)HPV感染都敏感。每一型HPV與特殊的臨床損害有關(guān)，且對(duì)皮膚或粘膜鱗狀上皮各有其好發(fā)部位。當(dāng)含有比較大量病毒顆粒的脫落表層細(xì)胞或角蛋白碎片進(jìn)入易感上皮裂隙中時(shí)，感染就可能產(chǎn)生，它可因直接接觸或少見的自動(dòng)接種或經(jīng)污染的內(nèi)褲、浴盆、浴巾、便盆感染。

　　病毒感染人體后，可潛伏在基底角朊細(xì)胞間，在表皮細(xì)胞層復(fù)制，HPV侵入細(xì)胞核，引起細(xì)胞迅速分裂，同時(shí)伴隨病毒顆粒的繁殖與播散，形成特征性的乳頭瘤。晚期基因表達(dá)結(jié)構(gòu)多肽，即出現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白裝配顆粒，病毒主要集中在顆粒層中的細(xì)胞核內(nèi)，在表皮的顆粒層出現(xiàn)凹空細(xì)胞增多，組織學(xué)上正常的上皮細(xì)胞也有HPV，治療后殘余的DNA常可導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)。

　　宿主對(duì)HPV感染引起的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞免疫與體液免疫兩個(gè)方面。

　　一、細(xì)胞免疫

　　人體細(xì)胞免疫狀態(tài)是影響CA發(fā)生、轉(zhuǎn)歸的重要基礎(chǔ)之一。細(xì)胞免疫比體液免疫更為重要。臨床上伴細(xì)胞免疫缺陷的尖銳濕疣患者皮疹常持續(xù)不退，其外周血中抑制性T細(xì)胞數(shù)增多NK細(xì)胞功能低下，r-干擾素和白細(xì)胞介素2產(chǎn)生減少，而消退疣皮損中常常出現(xiàn)活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞的浸潤(rùn)，部分角朊細(xì)胞HLA-DR陽(yáng)性。

　　免疫抑制或免疫缺陷時(shí)，生殖器HPV感染和HPV相關(guān)疾病的發(fā)生率均增加。尖銳濕疣中輔助性T細(xì)胞耗竭，CD4/CD8比值倒置，其值＜1。在CA病人的外周血中，發(fā)現(xiàn)抑制/細(xì)胞毒性T細(xì)胞百分率顯著增高，輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞的比值和輔助/抑制T細(xì)胞比值均降低。宮頸CA和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN)病損中朗格罕細(xì)胞明顯減少。CA中NK細(xì)胞 產(chǎn)生r-干擾素和白介素-2減少。鮑溫樣丘疹病和肛門生殖器癌者中NK細(xì)胞對(duì)含有HPV-16的角朊細(xì)胞的溶解活性下降，可能是對(duì)疾病特異性靶細(xì)胞的識(shí)別缺陷所致，宮頸CA的角朊細(xì)胞不表達(dá)MHCⅡ型抗原(HLA-DR)，無(wú)此抗原提呈功能可以破壞免疫監(jiān)視作用。 醫(yī).學(xué).全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn

　　二、體液免疫

　　目前血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：①抗晚期蛋白抗體產(chǎn)生率為25%-65%，較抗早期蛋白抗體產(chǎn)生率高；②檢測(cè)出的HPV抗體似有型特異性，無(wú)交叉反應(yīng)；③抗HPV-16E7抗體與宮頸癌的存在有密切關(guān)系；④抗HPV-16E4抗體也是發(fā)生宮頸癌、復(fù)發(fā)或近期HPV感染的標(biāo)志；⑤估計(jì)成人和兒童產(chǎn)生IgG抗體的陽(yáng)性率相同，不同型別陽(yáng)性率在10%-75%之間；⑥已證明HPV-16或18型腫瘤抗體陽(yáng)性患者中，僅50%-70%可檢出該抗體。

　　三、尖銳濕疣自然消退

　　對(duì)CA自然消退尚無(wú)系統(tǒng)評(píng)估，然而以安慰劑對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)其自然消退率在0%，17%、18%和69%之間，CA消退或治愈后，仍有45%患者存在潛伏感染，其中67%患者復(fù)發(fā)。

【流行病學(xué)】　返回

　　一、流行情況

　　尖銳濕疣為人類乳頭瘤病毒所引起。目前一致認(rèn)為此病在增多，成為STDS中的最常見疾病，在年輕成人中患病率可達(dá)0.5%-1%。英國(guó)尖銳濕疣發(fā)病率從1970年的30/10萬(wàn)增到1988年的260/10萬(wàn)，幾乎增加了8倍，美國(guó)此病發(fā)病率從1966年到1984年增加了6倍。和艾滋病相似，有癥狀的尖銳濕疣僅代表感染者的“冰山”之頂，所以如考慮亞臨床感染在內(nèi)，人類乳頭瘤病毒感染可能是發(fā)病率占第一位的性病。此感染的傳播方式包括直接與間接傳播，但以性接觸最為常見，而且越是近期損害越有傳染性，一次性接觸估計(jì)有50%被傳染的可能性；其次為直接非性接觸，如自體傳染以及新生兒經(jīng)產(chǎn)道受染；再其次為間接接觸，通過(guò)污染傳染、推測(cè)有可能，但因此病病毒尚不能培養(yǎng)，未能證實(shí)。

　　二、尖銳濕疣發(fā)生的危險(xiǎn)因素

　　（一)性行為：性伴數(shù)及過(guò)早性交是造成發(fā)生HPV感染的因素。

　�。ǘ�)免疫抑制：HPV感染和與HPV有關(guān)的癌似乎是慢性免疫功能抑制的晚期并發(fā)癥。腎異體移植者中患CA的危險(xiǎn)性增加。

　�。ㄈ�)HIV感染：HIV陽(yáng)性發(fā)生HPV感染及HPV相關(guān)腫瘤的機(jī)率增加。

　�。ㄋ�)年齡，妊娠：在婦科涂片中檢測(cè)HPV高峰流行率的年齡為20-40歲，隨著年齡增加，流行率穩(wěn)步下降；妊娠期間的HPV檢出率高，產(chǎn)后HPV檢出率下降。

【臨床表現(xiàn)】　返回

　　潛伏期3周到8個(gè)月，平均3個(gè)月，多見于性活躍的青、中年男女，發(fā)病高峰年齡為20-25歲，病程平均在3-5個(gè)月的男女患者，在性接觸后不久即發(fā)病，而病程平均12個(gè)月的男性患者，其性接觸者可不發(fā)病。多數(shù)患者一般無(wú)癥狀。損害大小及形狀不等。可僅為數(shù)個(gè)，亦可為多數(shù)針頭樣大的損害：在陰肛部可長(zhǎng)成大的腫瘤樣物，有壓迫感；有惡臭味；有時(shí)小的濕疣可出現(xiàn)陰部痛癢不適，病人可出現(xiàn)尿血和排尿困難；直腸內(nèi)尖銳濕疣可發(fā)生疼痛、便血，而直腸內(nèi)大的濕疣則可引起里急后重感。

　　男性患者好發(fā)于包皮系帶、冠狀溝、包皮、尿道、陰莖、肛門周圍和陰囊。病初為淡紅或污紅色粟狀大小贅生物，性質(zhì)柔軟，頂端稍尖，逐漸長(zhǎng)大或增多�？砂l(fā)展成乳頭狀或囊狀，基底稍寬或有帶，表面有顆粒。在肛門部常增大，狀如菜花，表面濕潤(rùn)或有出血，在顆粒間常積存有膿液，散發(fā)惡臭氣味，搔抓后可繼發(fā)感染。位于濕度較低干燥部位的生殖器疣，損害常小而呈扁平疣狀。位于濕熱濕潤(rùn)部位的疣常表現(xiàn)為絲狀或乳頭瘤狀，易融合成大的團(tuán)塊。有嚴(yán)重肝病的患者濕疣可增大。妊娠可使?jié)耩鄰?fù)發(fā)或生長(zhǎng)加快。

　　亞臨床感染是指臨床上肉眼不能辨認(rèn)的病變，但用3%-5%醋酸液局部外涂或濕敷5-10分鐘可在HPV感染區(qū)域發(fā)白，即所謂“醋酸白現(xiàn)象”。

　　HPV感染和腫瘤的發(fā)生：

　�。ㄒ�)HPV與皮膚腫瘤的發(fā)生有關(guān)

　　它在皮膚癌和其他解剖部位的腫瘤似乎起決定作用�？谇涣夹再樕�物和癌前病變，皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中可發(fā)現(xiàn)HPV-11、16、18型DNA，曾報(bào)道喉部HPV-6乳頭瘤惡變成喉癌，皮膚疣狀表皮發(fā)育不良（EV)是HPV潛在致癌作用的證據(jù)，EV皮損中發(fā)現(xiàn)多種HPV型DNA，并在患者皮膚鱗狀細(xì)胞癌中檢出HPV-5、8、14、17及20型，皮膚鱗狀細(xì)胞癌似乎是由先已存在的病毒性損害惡變而來(lái)。

　　（二)尖銳濕疣與肛門生殖器癌

　　生殖器癌與HPV類型有一定的關(guān)系。利用DNA雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)生殖器癌組織中存在HPV-6、11、16、18型等。

　　1．宮頸癌：根據(jù)HPV與宮頸癌的關(guān)系，可將其分為兩大類型：低危型主要指HPV-6、11型，高危型是指HPV-16、18型，Gissmann等觀察到在侵襲性宮頸癌中，有57.4%患者存在著HPV-16、18型，其他學(xué)者也有相同發(fā)現(xiàn)。還有人從侵襲性宮頸癌中分離出HPV-33和35型。

　　2．皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC)：HPV感染而發(fā)生的CA也可能是癌前損害，并可發(fā)展成肛門生殖器SCC，這表明HPV是女陰、陰莖及肛門生殖器SCC的重要因素。CA，巨大CA和疣狀SCC組成一個(gè)生殖器癌前病變和癌的損害病譜，有些部位生殖器癌病例在其周圍皮膚有CA存在，有時(shí)肉眼見為典型的CA，但組織學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)SCC的孤立病灶。 醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

　　3．鮑溫樣丘疹�。撼Ｒ娪陉幥o、女陰或肛門周圍，曾在皮損內(nèi)發(fā)現(xiàn)HPV-16型DNA。

【輔助檢查】　返回

　　一、醋酸白試驗(yàn)

　　用3-5%醋酸外涂疣體2-5分鐘，病灶部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鐘。本試驗(yàn)的原理是蛋白質(zhì)與酸凝固變白的結(jié)果，HPV感染細(xì)胞產(chǎn)生的角蛋白與正常的未感染上皮細(xì)胞產(chǎn)生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗(yàn)檢測(cè)HPV的敏感性很高，它比常規(guī)檢測(cè)觀察組織學(xué)變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陽(yáng)性變白跡象顯得界限不清和不規(guī)則。美國(guó)CDC提示，醋酸白試驗(yàn)并不是特異試驗(yàn)，且假陽(yáng)性較常見。

　　二、免疫組織學(xué)檢查

　　常用過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶方法（即PAP)，顯示濕疣內(nèi)的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽(yáng)性時(shí)，尖銳濕疣的淺表上皮細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)淡紅色的弱陽(yáng)性反應(yīng)。

　　三、組織化學(xué)檢查

　　取少量病損組織制成涂片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結(jié)合。在過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶（PAP)方法中，核可被染成紅色。此法特異性強(qiáng)且較迅速，對(duì)診斷有幫助。

　　四、病理檢查

　　主要為角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長(zhǎng)，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細(xì)胞和基底細(xì)胞并有相當(dāng)數(shù)量的核分裂、頗似癌變。但細(xì)胞排列規(guī)則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點(diǎn)為粒層和刺層上部細(xì)胞有明顯的空泡形成。此種空泡細(xì)胞較正常大，胞漿著色淡、中央有大而圓，深嗜堿性的核。通常真皮水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及周圍較致密的慢性炎性浸潤(rùn)。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣，表皮極度向下生長(zhǎng)，代替了其下面的組織、易與鱗狀細(xì)胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發(fā)展之傾向， 則為一種低度惡變的過(guò)程，即所謂疣狀癌。

　　五、基因診斷

　　迄今，HPV難于用傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)，主要實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)是核酸雜交。近年來(lái)發(fā)展的PCR方法具有特異、敏感、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，為HPV檢測(cè)開辟了新途徑。

　�。ㄒ�)標(biāo)本的采集及處理

　　1．標(biāo)本的采集和預(yù)處理：用刮板或生理鹽水浸潤(rùn)的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細(xì)胞。在作細(xì)胞學(xué)檢查的同時(shí)，將標(biāo)本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心（3000g，10min)洗滌2次，沉積細(xì)胞重懸于1mlPBS中，取0.5ml細(xì)胞懸液抽提DNA。

　　2．標(biāo)本核酸的提�。喊�1體積細(xì)胞懸液加10倍體積的細(xì)胞裂解液（10mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K)37℃下處理過(guò)夜;且等體積酚/氯仿(1:1)，氯仿/異戊醇（24:1)各抽提2次；加1/10體積3mol/L NaAc（pH 5.2)及2.5倍體積無(wú)水乙醇置-20℃ 2h或過(guò)夜沉淀DNA；加1體積乙醇洗滌1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37℃溫育30min。

　�。ǘ�)PCR擴(kuò)增

　　1．　引物設(shè)計(jì)和合成：HPV基因組可分為早期區(qū)（E)和晚期區(qū)（L)，每區(qū)含一系列開放讀碼框架（ORF)。序列分析表明，各型HPV的非編碼區(qū)及E1、E6、E7和L1區(qū)均有保守序列。Manos等從HPVL1區(qū)中選擇保守序列設(shè)計(jì)合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補(bǔ)序列，也可擴(kuò)增其它型HPV。 醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站www.med126.com

　　Manos等設(shè)計(jì)的HPVL1通用引物

　　MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG

　　MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC

表1

　　　M=A+C， R=A+G，W=A+T，Y= C+T

　　表2列述了Manos等設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針。公用混合探針序列選自HPVL1區(qū)中另一保守序列，可與　 　 　  MY11和MY09引物產(chǎn)生的多種HPVL1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交：型特異探針只與相應(yīng)HPV型有互補(bǔ)序列，用于檢出的HPV分型。

表2　  Manos等設(shè)計(jì)的HPVL1 PCR產(chǎn)物探針

　　H=A+C+T，R=A+G，W=A+T，Y=C+T

　　2．PCR反應(yīng)試劑：Taq DNA聚合酶（2U/ml)、10mmol/L dNTP貯備液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L)，10×PCR緩沖液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。

　　3．PCR擴(kuò)增方法和程序：以100μl PCR反應(yīng)液,用無(wú)菌0.5ml硅化塑料離心管為反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

　�。�1)實(shí)驗(yàn)前配制預(yù)混反應(yīng)試劑并分裝。預(yù)混反應(yīng)試劑包括除標(biāo)本DNA外的其它各種PCR反應(yīng)試劑。每支反應(yīng)管中含有的PCR反應(yīng)試劑見表3。

表3　 　每支反應(yīng)管中的PCR反應(yīng)試劑

　�。�2)各反應(yīng)管依次加入10μl標(biāo)本和90μl預(yù)混反應(yīng)試劑。

　�。�3)加入80-100μl石蠟油，在臺(tái)式離心機(jī)上快速離心數(shù)秒鐘，使各反應(yīng)試劑收集于油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應(yīng)體積為25μl。使用時(shí)只加入標(biāo)本DNA即可。

　�。�4)將反應(yīng)管置PCR擴(kuò)增儀上，循環(huán)參數(shù)為95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。

　　4．每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照。以載有HPV的重組質(zhì)粒（每反應(yīng)為100pg)或含有HPV的細(xì)胞系（如Caski、HeLa)DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)HPV的人細(xì)胞系DNA為陰性對(duì)照。

　�。ㄈ�)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析

　　1．　凝膠電泳：擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結(jié)果，分子量約為450bp處出現(xiàn)明顯的DNA帶。

　　2．　核酸雜交：如果凝膠電泳無(wú)清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時(shí)，可用標(biāo)記的公用混合探針和（或)型特異探針作Southern吸印雜交、斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證。 醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站www.med126.com

　　按照標(biāo)準(zhǔn)方法制32P ATP標(biāo)記的寡核苷酸探針，需達(dá)到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振蕩下雜交2-3h，隨后于30-55℃下用洗滌液（2×SSC、0.1%SDS)迅速?zèng)_洗雜交膜，除去多余探針。然后進(jìn)行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10 min，并換液重洗1次；MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。

　　用PCR方法檢測(cè)HPV比核酸雜交方法優(yōu)越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結(jié)果，可檢出標(biāo)本中200個(gè)拷貝的HPV DNA，若以核酸雜交檢測(cè)PCR產(chǎn)物，敏感性提高，能檢出10個(gè)拷貝的HPV DNA。

　　鑒于PCR技術(shù)的高度敏感性，以生殖道脫落細(xì)胞為檢材足以滿足試驗(yàn)要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，觀察產(chǎn)生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術(shù)檢測(cè)HPV實(shí)驗(yàn)周期短、簡(jiǎn)便快速。

【鑒別診斷】　返回

　　1．生殖器鱗癌；多見于40歲以上或老年人，皮損向下浸潤(rùn)，發(fā)生潰瘍，組織病理有特征性改變。

　　2．扁平濕疣：為多個(gè)濕丘疹融合成片狀的皮損，多見于肛周，皮損處可查到梅毒螺旋體，梅毒血清試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)。

　　3．珍珠狀陰莖丘疹�。簽檠毓跔顪吓帕�，針頭及粟粒大小的皮色或淡粉紅色丘疹。組織病理無(wú)凹空細(xì)胞。

　　4．假性濕疣；損害為局限于小陰唇的粟粒大呈魚卵狀淡紅色小丘疹或絨毛狀改變，皮損表面光滑，醋酸白試驗(yàn)陰性，病理上無(wú)具有診斷意義的凹空細(xì)胞。

　　5．鮑溫樣丘疹病；為棕紅色或色素性小丘疹，組織病理可見異型鱗狀細(xì)胞及類似原位癌的組織象。

【預(yù)防】　返回

　　控制性病是預(yù)防CA的最好方法。發(fā)現(xiàn)治療患者及其性伴；進(jìn)行衛(wèi)生宣教和性行為的控制；陰莖套具有預(yù)防HPV感染的作用，目前尚無(wú)有效疫苗。