五、不對稱PCR（Asymmetric PCR)
不對稱PCR的基本原理是采用不等量的一對引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ss-DNA)。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物；其最佳比例一般為1：50～1：100，關(guān)鍵是限制引物的絕對量。限制性引物太多太少，均不利于制備ss-DNA。也可用普通PCR制備靶DNA雙鏈DNA（ds-DNA)，再以ds-DNA為模板，只用其中一種過量引物進行單引物PCR制備ss-DNA。
產(chǎn)生的ds-DNA與ss-DNA由于分子量不同可以在電泳中分開，而得到純ss-DNA。
不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA，尤為用cD－NA經(jīng)不對稱PCR進行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。
六、標(biāo)記PCR（LP-PCR)和彩色PCR
LP-PCR（Labelled Primers PCR)是利用同位素、熒光素等對PCR引物5’端進行標(biāo)記，據(jù)此檢測目的基因的存在與否，與常規(guī)PCR相比更為直觀，省去了限制性內(nèi)切酶酶切及分子雜交等繁瑣步驟，而且一次可以同時分析多種基因成分，因而特別適合于大量臨床標(biāo)本的基因診斷。目前該方法只對PCR產(chǎn)物進行定性鑒定。
彩色PCR（Color complement assay)直譯為“著色互補性檢測”，是LP-PCR的一種，彩色PCR意譯更為明確：它用熒光染料標(biāo)記引物的5’端。熒光染料JOE和FAM呈綠色熒光；TAMRA呈紅色熒光；COUM呈藍色熒光。不同熒光標(biāo)記的引物同時參加反應(yīng)，擴增后的目的基因會分別帶有引物5’端的染料，通過電泳或離心沉淀，肉眼就可以根據(jù)不同熒光的色澤判斷目標(biāo)基因是否存在及擴增基因的類型。通常僅需2種不同顏色的引物，一種作為基因檢測引物；另一種作為控制條件的內(nèi)對照，即可診斷基因缺失、染色體易位或感染某種病毒。檢測多種點突變時，可用更多的色彩，如多點突變的遺傳病、幾種可疑病毒感染、HLA位點分析都可以用彩色PCR同時檢測多個位點。
七、加端PCR
加端PCR（add-PCR)是使擴增產(chǎn)物的5’-末端加一段DNA順序的PCR。設(shè)計加端PCR的引物時，除與模板配對的那一部分外再加上若干堿基，這樣使擴增產(chǎn)物的末端加上額外一段DNA，如加上一個限制酶的識別順序或特定功能的DNA片段。Stoflet等報道在結(jié)構(gòu)基因前加上噬菌體T7的啟動子，當(dāng)然也可用于DNA片段的末端標(biāo)記或引入特定的點突變。末端可加堿基的數(shù)量與引物的長短有關(guān)，當(dāng)引物足夠長時擴增產(chǎn)物或末端甚至可以加上十幾個到幾十個堿基。
八、錨定PCR或固定PCR
錨定PCR（Anchored PCR, A-PCR)主要用于分析具有可變末端的DNA序列，Loh等用A-PCR對人外周血淋巴細胞T細胞受體α-鏈的mRNA的多變性進行了分析。先合成cDNA，并用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在其3’-可變區(qū)末端加上一個PolyG尾巴。Loh等恒定區(qū)與可變區(qū)連接部位設(shè)一個引物，另一個引物是一個具5’-polyG尾巴的引物。帶有PolyG尾巴的引物是一個固定點，它可以并與PolyG尾巴結(jié)合，無論其余部分序列如何，只識別片段末端，利用此法可從前述mRNA中檢出至少20種不同序列，每一種都是獨特的，表明A-PCR不對任何特殊序列有傾向性結(jié)果，可用于T細胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。
九、玻片PCR
在聚丙烯管中可以對多種含膜板材料進行PCR，而在顯微玻片上用組織細胞涂片或切片直接進行DNA擴增的方法就稱為玻片PCR（Slide-PCR)。
圖22-3 錨定PCR原理示意圖
先將細胞涂片或呈單層細胞，然后用甲醇/醋酸（3：1，V/V)、Carnoy溶液、無水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5～15min。用蒸餾水沖洗，干燥，直接使用或保存于-20℃?zhèn)溆�。在玻片上�?0mm×28mm為免疫組化反應(yīng)區(qū)。加入30μl PCR反應(yīng)混合液，其中含10mmol/L Tris pH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/l dNTPs,100nmol/L引物，0.01%（V/V)明膠，0.2% BSA, 2.5u/100μl Taq酶。然后蓋上22mm×40mm的蓋玻片，邊緣用石蠟油封好。把玻片放入PCR熱循環(huán)儀金屬塊上，使金屬塊與樣品呈最大程度接觸，同在聚丙烯管中一樣，進行30～40個循環(huán)。對于較短的擴增片段在后期循環(huán)中變性溫度可降低。反應(yīng)后，將致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蠟油，但不取出蓋玻片，用一個尖鑷子輕輕拈起蓋玻片一角，在相對的一角中PCR反應(yīng)混合液呈半月形液面，用移液器回收。一般可回收25μl混合液，將反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳或用套式PCR引物按標(biāo)準(zhǔn)PCR進行重新擴增。片上擴增物可做原位雜交顯示。
在Slide-PCR中，需0.1%～1%的BSA。加入BSA可以保證擴增結(jié)果，但效率不一定很高。明膠（至少0.0001%),對擴增1kb左右的靶DNA十分重要。但對小片段擴增結(jié)果影響不大。不同的樣品提取方法或固定法對Slide-PCR都可行。
Silde-PCR的機理可能是在起始變性過程中一部分DNA從細胞中洗提出來，然后在細胞和玻片的水相中進行PCR。用地高辛標(biāo)記的人全基因組DNA探針雜交表明在起始循環(huán)中DNA極微量，而30個循環(huán)后很豐富。常規(guī)細胞染色表明只有少量的形態(tài)改變。
Silde-PCR對于玻片上的細胞樣品提供了一種較好的方法，而不必再把這些樣品從玻片上括下來，使操作簡便，污染減少。本方法對于原樣品量極微且需病史追蹤保存的（如子宮頸涂片或涂片)具有實用價值。
十、反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測RNA
RNA的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)是以RNA為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcrip－tion, RT)與PCR，可用于檢測單個細胞或少數(shù)細胞中少于10個拷貝的特異DNA，為RNA病毒檢測提供了方便；并為獲得與擴增特定的RNA互補的cDNA提供了一條極為有利和有效的途徑。醫(yī)學(xué) 全在.線提供www.med126.com
RNA擴增包括兩個步驟：①在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補鏈cDNA；②加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴增靶DNA。
在RT-PCR中關(guān)鍵步驟是RNA的逆轉(zhuǎn)錄，cDNA的PCR與一般PCR條件一樣。由于引物的高度選擇性，細胞總RNA無需進行分級分離，即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR對RNA制品的要求極為嚴格，作為模板的RNA分子必須是完整的，并且不含DNA、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。RNA中即使含有極微量的DNA，經(jīng)擴增后也會出現(xiàn)非特異性擴增；蛋白質(zhì)未除凈，與RNA結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)錄和PCR；殘存的RNase極易將膜板RNA降解掉。硫氰酸胍（GaSCN)-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法為佳，適合一般實驗室進行。
常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即禽類成髓細胞性白血病病毒（Avian myeloblastosis virus, AMV)和莫洛尼鼠類白血病病毒（Moloney murine leukemia virus, MO-MLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT)。一般情況下用Mo-MLV-RT較多，但模板RNA的二級結(jié)構(gòu)嚴重影響逆轉(zhuǎn)錄時，可改用AMV-RT，因后者最適溫度為72℃，高于Mo-MLV-RT的最適溫度（37℃)，而較高的反應(yīng)溫度有助于消除RNA的二級結(jié)構(gòu)。
一步法擴增（one step amplification)是為了檢測低豐度mRNA的表達，利用同一種緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄和其后的PCR擴增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化，所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA。該法還可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cD－NA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在一個試管中進行。
最近Cetus公司推出rTth逆轉(zhuǎn)錄酶，兼具有DNA多聚酶的活性，對于RNA的發(fā)展起了很大的推動作用。有關(guān)rTth逆轉(zhuǎn)錄酶法參考第四節(jié) 有關(guān)內(nèi)容。
十一、定量PCR
1．DNA-PCR定量用同位素標(biāo)記的探針與電泳分離后的PCR擴增產(chǎn)物進行雜交，根據(jù)放射自顯影后底片曝光強弱可以對模板DNA進行定量。Abbot等利用這種方法對人類T細胞白血病反轉(zhuǎn)錄基因進行了定量研究。
PCR擴增產(chǎn)物用專為檢測ds-DNA而設(shè)計的微量熒光計定量，利用染料H33258專與雙鏈DNA結(jié)合而使熒光增強50倍的特性�？梢詮臉�(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋擴增產(chǎn)物量曲線上讀出樣品中模板DNA的量或拷貝數(shù)，達到PCR定量的目的。
利用倍比稀釋模板作系列稀釋PCR，求出最低（PCR-EB)檢測限來比較，也是常用的半定量PCR方法。
2．mRNA-PCR定量由于MRNA-PCR定量需經(jīng)兩個酶（RT和Taq)催化，因而影響因素較多。1989年Wang等報道了低豐度mRNA絕對定量方法。利用濃度已知且與待測靶mR-NA序列相同的內(nèi)對照mRNA（其片段長短不同，便于PCR擴增后產(chǎn)物的分離)，在同一體系中，用相同的由32P標(biāo)記的引物與待測mRNA一同進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳后，分別測定二者產(chǎn)物放射性強度，由預(yù)先制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出每個樣本特異mRNA的量。Gilliland等的結(jié)果表明，在1ng總RNA中可以對小于1pg的特異mRNA進行定量。這一定量方法在腫瘤、代謝失調(diào)、基因表達調(diào)控等研究中均有重要意義。
